阜外学者优化心肌细胞体外分离方法

想探索心肌细胞的电生理学、信号传导、药物测试以及单细胞转录组学？心肌细胞就是重要工具，但如何对胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞更好进行体外分离？

近日，中国医学科学院阜外医院聂宇与山西医科大学基础医学院王玉瑶等结合文献以及实验结果发现：

分离胚胎期小鼠心肌细胞可用胰酶消化法；

分离出生后 1~3 d 小鼠心肌细胞可用 Gentle MACS法；

对于出生后4 d 和 7 d 的小鼠，非 Langendorff灌流法可获得存活率及杆状率均较高的心肌细胞；

分离成年小鼠心肌细胞则适合用非 Langendorff灌流法和 Langendorff灌流法。

这项研究结果显示，用胰酶消化法分离胚胎期小鼠心肌细胞，获得存活率大于 94% 的心肌细胞，而且细胞状态良好。

研究者介绍，胰酶消化法所需胰酶体积及消化时间需根据心脏大小及心脏个数而定。一般来说，对于怀孕14.5 d的小鼠来说，消化10个心脏大约需 400 μl胰酶，37℃消化两次，每隔 5 min轻弹一次，即可获得存活率高的心肌细胞。

对于新生小鼠（出生后 1~3 d），心肌细胞的体外分离方法优先选择 Gentle MACS 法，可获得活性约 97% 的心肌细胞。

Gentle MACS 法中约20个心脏用一个体系的酶量（2.5 ml），心脏较多时只需相应增加酶量即可。此外，在分离程序结束后应立即用预热的含 10%FBS 的 DMEM 终止消化，否则会因消化过度而影响心肌细胞存活。

与 Gentle MACS 法相比，出生后4 d和7 d的小鼠心肌细胞体外分离可优先选择非 Langendorff灌流法，分得的心肌细胞存活率在 70%~80% 之间。

研究者介绍，用非 Langendorff 灌流法分离心肌细胞时，应严加把控注射酶的速度，速度过快会导致细胞断裂，杆状细胞率降低。此外，用37℃预热好的酶液进行注射最好。

另外出生后4 d和7 d小鼠可用低速离心的方法将心肌细胞沉淀，而 出生后56 d小鼠因心肌细胞体积较大且易断裂，应用自然沉降的方法进行细胞沉降，以去除非心肌细胞。

对于成年小鼠，非Langendorff 灌流法和Langendorff 灌流法均可获得杆状率、存活率都在 70%左右的心肌细胞。

这项研究中，研究者取胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心脏，运用不同方法分离心肌细胞。利用 Count Star 仪器检测心肌细胞大小及活性。取细胞悬液涂片，针对心肌细胞标志物 α 辅肌动蛋白（α-actinin）表达进行免疫荧光染色，用共聚焦显微镜观察心肌细胞形态。

来源：李燕，冯杰，聂宇，等. 胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离方法及优化. 中国循环杂志, 2020, 35: 706-712.

 

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