一文汇总 | 三阴性乳腺癌的诊断技术进展

作者：颐岭

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乳腺癌已成为全球第一高发癌症，根据Global Cancer 2020年数据显示^[1]，年龄标准化发病率达到47.8/10万。全球范围内，每年有新发乳腺癌患者2261419例，我国每年新发乳腺癌患者416371例，占全球新发病人数18.4%，而我国乳腺癌发病率仍呈上升趋势^[2]。

总体上，根据ER/PR/HER2的状态，基底标志物（CK5/6，EGFR），Ki-67增殖指数，可以将乳腺癌分为管腔A型（Luminal A）、管腔B型（Luminal B），HER2富集型（HER2 Enriched），基底样型（Basal-like），正常样型（Normal-like）以及Claudin-low型共6种不同的内在亚型^[3]。

图1：基于免疫组化结果的乳腺癌内在亚型^[3]

使用“管腔（luminal）型”这个名称，是因为这种类型的乳腺癌存在于乳房的管腔（内部）上皮细胞。Perou及其同事在2000年首次发现管腔型乳腺癌^[4]。这一类型乳腺癌涵盖了很大一部分ER阳性的乳腺癌患者。随后，管腔型乳腺癌患者又被分为管腔A型和管腔B型。管腔B型往往表达HER2和Ki67。因此，相比管腔A型，管腔B型肿瘤传播更快，预后较差。

HER2富集型乳腺癌往往ER和PR阴性，但HER2基因过表达。相比管腔型，HER2富集型乳腺癌生长速度快，预后差，但是可以从抗HER2治疗中获益。正常样型乳腺癌患者组织中肿瘤细胞比例低，增殖相关基因的表达较低。基底样型乳腺癌往往ER、PR和HER2均阴性，即所谓三阴性乳腺癌（TNBC）。

但并不是所有三阴性乳腺癌均是基底样型。Prat及其团队^[5]发现约70-80%的三阴性乳腺癌是基底样型乳腺癌。之所以叫基底样型（basal-like）是由于这类肿瘤细胞EGFR、CK5/6、CK14和 CK17的达与基底细胞（basal cell）相似。Claudin-low型乳腺癌也属于三阴性乳腺癌。这类肿瘤低表达E钙粘蛋白（E-cadherine），粘蛋白-1（mucin-1），上皮细胞黏附分子（EpCAM）和紧密连接蛋白（claudins）。除此之外，Claudin-low型与管腔型、HER2富集型和基底样型乳腺癌相比，增殖相关基因（Ki-67）和管腔型标志物的表达有限，但高表达上皮间充质转化（EMT）基因（CD14、CD79b和vav1）和癌症干细胞特征基因。

三阴性乳腺癌（TNBC）大概占所有乳腺癌人群的10-15%，相比其他亚型乳腺癌预后往往较差。TNBC被分为六种亚型^[6]，免疫调节型（IM）、管腔雄激素受体型（LAR）、基底样1型（BL-1）、基底样2型（BL-2）、间充质型（M）和间充质干细胞样型（MSL），如图2所示。这些类型根据其基因表达组合进行分类。

图2：三阴性乳腺癌的内在亚型^[3]

BL-1型高表达DNA复制和修复的相关基因，而BL-2型高表达生长因子信号传导相关基因。IM型高表达与免疫过程相关的基因，如NK细胞通路、TH1/TH2通路、炎症因子信号传导、B细胞受体（BCR）和抗原加工等相关基因。LAR型高表达雄激素受体及其调节途径的基因。此外，MSL型和M型均高表达与细胞外受体相互作用、细胞运动和细胞分化途径相关的基因。但与M型不同，MSL型低表达claudins。

Lehmann等研究^[7]发现IM型和MSL型TNBC中的转录物分别来自肿瘤浸润淋巴细胞和肿瘤相关的基质细胞，因此又将TNBC重新分为BL-1型、BL-2型、M型和LAR型四种亚型。不同的TNBC具有不同的基因表达特征和生物学特征，理论上会对不同的治疗方案敏感性不同。因此。对于TNBC患者的精确诊断，有利于制定其后续的治疗方案。

表1：不同的三阴性乳腺癌使用不同的治疗方案^[3]

目前对于TNBC的诊断主要依赖于免疫组化（IHC）技术。ASCO/CAP（American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists）制定了多项指南，确保每次诊断的可靠性和可重复性，降低假阴性和假阳性的发生率。即便目前有指南的规范，但是受IHC技术的限制，TNBC的诊断往往比较耗时，同时检测结果准确性对操作者的依赖性较强。然而，随着分子生物学的进展，已经出现了一些新的技术方法来提高TNBC的诊断效率和准确度。

基于血液样本的液体活检

基于血液样本的液体活检是一类无创诊断方法，通过在血液标本中分析循环肿瘤细胞（CTC）和循环肿瘤核酸（ctNA）包括循环肿瘤DNA（ctDNA）和microRNA（miRNA）的存在，来获得肿瘤的信息。

循环肿瘤核酸（ctNA）

在癌症患者血液中发现的ctDNA通常来自原发肿瘤、CTC、以及肿瘤发生和进展过程中凋亡和坏死的细胞。血液中肿瘤ctDNA的含量取决于原发灶或转移灶的大小，因此ctDNA的含量可以反应肿瘤负荷的大小。

由于ctDNA具有较短的半衰期（15分钟到几小时），因此相比影像学检查，可以更好的实时反应肿瘤负荷以评估治疗方案的有效性。另外，有研究表明ctDNA分析能够检测早期乳腺癌患者的疾病转移和复发，因此可以作为乳腺癌转移复发的替代诊断方法。目前ctDNA在乳腺癌诊断中的应用还在进一步发展和验证中。

microRNA（miRNA）是由约22个核苷酸组成的短链RNA，可以与目标mRNA结合来调节数千个基因的表达。miRNA参与细胞发育、生长、分化、死亡、染色体结构、代谢和形态发生等过程。此外，致癌miRNA或抑癌miRNA在肿瘤发生发展中也起到重要作用。多项研究发现，在乳腺癌患者血液样本中存在一些特定的miRNA。进一步研究发现，特定miRNA的表达水平和肿瘤类型、肿瘤分期、分级相关。目前已经有研究者通多检测多个miRNA组成的基因标签来尝试筛查乳腺癌，但是由于样本人群比较局限，目前该方法还在进一步验证中。

外泌体

外泌体是细胞分泌于胞外的膜结合囊泡，由Pan和Johnstone于1983年首次报道。主要参与将生物分子（如，DNA、RNA、蛋白质和脂质）运输到受体细胞，参与细胞信号传导和细胞间分子通讯过程。癌细胞的外泌体可以触发增殖和免疫逃逸过程，进而造成癌症进展和转移。有研究表明，外泌体蛋白可用作诊断和预后预测的潜在标志物。

免疫正电子发射断层扫描（免疫PET成像）

免疫PET成像利用单克隆抗体来定位位于细胞外基质或细胞表面的特定标志物，进而被PET检测系统识别，最终提高肿瘤诊断的效率。2017年，一项研究^[8]发现非转移性黑色素瘤糖蛋白B（gpNMB）高表达于TNBC患者，并且参与肿瘤的发生和进展过程。随后在TNBC异体移植瘤模型中成功开发了靶向gpNMB的成像抗体试剂用于TNBC的免疫PET成像诊断。

免疫PET成像不仅可以参与乳腺癌的早期诊断，而由于其针对潜在治疗靶点进行成像，因此诊断结果可以直接影响患者治疗方案的确定。

纳米生物传感器

生物传感器是由生物受体、信号转换器和检测器三部分组成的分析工具，可以用于包括酶、免疫成分（抗原和抗体）、核酸成分（DNA、RNA、miRNA和ctDNA）以及其他生物成分的鉴定和分析。

生物受体是一种固定的敏感生物元件（酶、DNA探针、抗体），可以特异性识别分析物（酶底物、互补DNA、抗原）。生物传感器将分析物与生物受体相互作用发出的（生物）化学信号转换为电子信号。信号强度与分析物的浓度相关，因此检测器可以通过分析信号强度对分析物的浓度进行分析。

纳米生物传感器是一种将纳米颗粒与传感器相结合的生物传感器。由于纳米颗粒尺寸小（表面积体积比高），可以通过识别低浓度的生物分析物来放大传感器的接收能力，从而提高检测灵敏度。

已经有研究证明，纳米生物传感器可以检测肿瘤相关miRNA等生物样本，用于乳腺癌的诊断。另外，已经有纳米生物传感器具备识别和区分癌、非癌（正常）和转移性乳腺癌细胞的能力，提示纳米生物传感器具有巨大的分析和诊断潜力^[9]。

图3：纳米生物传感器的工作原理[3]

一般而言，不同分型的乳腺癌具有不同的基因表达谱。因此，理论上可以通过检测基因表达谱来对乳腺癌进行精准诊断。nCounter® Breast Cancer 360™ Panel和数字化PCR就是基于该原理开发的诊断技术。

nCounter^® Breast Cancer 360™大约包含770个基因，提供了乳腺癌本身生物学特征以及免疫防御机制和肿瘤微环境的信息，可用于乳腺癌分子分型。

数字PCR（dPCR）是一种在扩增过程开始之前将样品分离到多个孔中的PCR方法。dPCR可用于癌症患者ctDNA和miRNA的鉴定。目前已经有4重ddPCR用于同时分析四种癌基因（PUM1、ESR1、PGR和ERBB2），从而确定乳腺癌亚型^[10]。

表2：三阴性乳腺癌不同亚型的基因表达谱^[3]

不同于HER2富集型乳腺癌可以使用抗HER2治疗，管腔型乳腺癌可以使用内分泌治疗。TNBC往往只能使用化疗。而实际上TNBC具有不同的基因表达谱，可以进一步分为不同的亚型。多项临床研究表明，部分TNBC可以选择化疗以外的治疗方案。比如gBRCA突变的患者可以使用PARP抑制剂，PD-L1阳性的患者可以使用免疫检查点抑制剂。而TNBC的精确诊断对于其个体化方案的制定至关重要。随着新的检测方法的不断开发，除了提高诊断准确度和效率之外，还可以实时评估患者对治疗方案的应答效果，进而调整后续的治疗方案，做到真正的全程个体化治疗。而乳腺癌诊断的进步不仅局限于TNBC，毫无疑问，可以扩展到所有乳腺癌患者。相信在不远的未来，所有乳腺癌患者都可以依赖于更加快速、准确的诊断结果制定个体化治疗方案，最终获得最佳的治疗效果。

参考文献：

[1].International Agency for Research on Cancer 2020, World Health Organization （https://gco.iarc.fr/today/home）;

[2].Lei S, Zheng R,et al. Breast cancer incidence and mortality in women in China: temporal trends and projections to 2030. Cancer Biol Med. 2021 May 18;18（3）:900–9.

[3].Dass SA, Tan KL, et al. Triple Negative Breast Cancer: A Review of Present and Future Diagnostic Modalities. Medicina （Kaunas）. 2021 Jan 12;57（1）:62.

[4].Perou, C.M, Sørlie, T, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature 2000, 406, 747–752.

[5].Prat, A, Parker, J.S, et al. Phenotypic and molecular characterization of the claudin-low intrinsic subtype of breast cancer. Breast Cancer Res. 2010, 12, R68.

[6].Lehmann, B.D, Bauer, J.A, et al. Identification of human triplenegative breast cancer subtypes and preclinical models for selection of targeted therapies. J. Clin. Investig. 2011, 121, 2750–2767.

[7].Lehmann BD, Jovanović B, et al. Refinement of Triple-Negative Breast Cancer Molecular Subtypes: Implications for Neoadjuvant Chemotherapy Selection. PLoS One. 2016 Jun 16;11（6）:e0157368.

[8].Marquez-Nostra, B.V, Lee, S, et al. Preclinical PET imaging of glycoprotein non-metastatic melanoma B in triple negative breast cancer: Feasibility of an antibody-based companion diagnostic agent. Oncotarget 2017, 8, 104303–104314.

[9].Tao, Y.; Li, M, Auguste, D.T. Pattern-based sensing of triple negative breast cancer cells with dual-ligand cofunctionalized gold nanoclusters. Biomaterials 2017, 116, 21–33.

[10].Chen,W, Zheng, J, et al. Breast Cancer Subtype Classification Using 4-Plex Droplet Digital PCR. Clin. Chem. 2019, 65, 1051–1059.