ROF 高峰论“道”④｜陆荫英教授：聚焦精准，探讨肝癌生物标志物的现状与进展

肝癌为我国常见的恶性肿瘤之一。由于早期无典型临床症状，故大部分肝癌患者一经确诊，疾病已发展至中晚期，预后欠佳。随着检测技术、靶向药物及免疫治疗在肝癌领域的发展和普及，生物标志物在肝癌的早期诊断、精准治疗及预后预测方面发挥着越来越重要的作用。在2022年7月9日罗氏肿瘤高峰论坛（Roche Oncology Forum，ROF）召开之际，医脉通特邀解放军总医院第五医学中心陆荫英教授介绍生物标志物在肝癌精准治疗领域的应用现状及未来方向。 

专家简介

陆荫英教授

解放军总医院第五医学中心肝病科副主任兼肝脏肿瘤科主任

北京大学医学部特聘专家

清华大学合成与系统生物学中心特聘研究员

中国老年学及老年医学学会 转化医学分会执行主席

亚太肝病诊疗技术联盟  肝癌学术委员会主委

中国研究型医院协会/分子诊断专委会副主委

欧美同学会/医师协会青委会秘书长 

“一带一路”肝胆肿瘤及传染病国际大会执行主席     

国际灾害医学应急救援大会（IPRED）主席团成员           

科技部“重大专项”评审专家   国家自然基金面上项目 评审专家

生物标志物引领肝癌精准诊疗新模式

随着精准医疗的不断升温，生物标志物对肝细胞癌（HCC）早筛早诊、术后复发转移监测、疗效预测、不良反应监测、获益人群筛选及新药研发等具有重要指导意义，因而备受关注。陆教授介绍，目前，甲胎蛋白（AFP）、甲胎蛋白异质体（AFP-L3）以及异常凝血酶原（PIVKA-II）等是成熟应用于临床的HCC诊断生物标志物，有效辅助临床医师诊断。然而研究者未停止对生物标志物的进一步探索，以“深度挖掘成熟生物标志物潜力”以及“积极寻找新型生物标志物”为方向不断前行。 在挖掘成熟生物标志物潜力方面，GALAD模型使传统的生物标志物焕发了“全新的活力”。该模型是一种基于患者性别、年龄、AFP-L3、AFP、PIVKA-II构建的HCC诊断模型，弥补了超声检查的局限性1。在一项病例对照研究中，GALAD模型曲线下面积（AUC）达0.97，高于AFP（AUC=0.88）、AFP-L3（AUC=0.84）和PIVKA-II（AUC=0.9），提示GALAD模型效能优于传统单一肿瘤标志物1。

与此同时，一些新型无创的生物标志物，如循环游离微小核糖核酸（miRNA）、循环肿瘤细胞DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTC）及外泌体等正在积极探索中，以用于HCC诊断。陆教授分享道，樊嘉院士团队开发的由7种血浆miRNA组成的生物标志物在HCC早期诊断领域对现有的血清学生物标志物进行了有效的补充2，使得大批原来由于缺乏有效诊断而失去治疗机会的肝癌患者得到及时的治疗。

除了血清学生物标志物外，微生物相关生物标志物领域亦是“热火朝天”。既往研究显示，肠道微生物代谢变化可作为肝癌早期诊断和疗效预测的生物标志物。由于口腔微生物与肠道微生物可以交互影响，亦有研究者开展了基于口腔微生物的生物标志物探索。陆教授介绍了一项来自解放军总医院第五医学中心的探索性研究。该研究采集了乙肝、肝硬化及HBV相关HCC患者唾液、牙菌斑及舌苔的微生物标本，随后对患者不同部位的微生物进行了检测。结果发现，在不同患者人群中，不同部位的微生物菌群具有不同的特征，并提示口腔微生物或可成为肝癌早期诊断的标志物。陆教授强调，目前肠道及唾液微生物相关生物标志物仍处于研究阶段，距离临床应用尚需时间。 随着越来越多的生物标志物被相继发现并应用于临床实践，临床亟需贴合当前HCC生物标志物研发、应用现状的规范。为规范及指导肝胆系统原发恶性肿瘤相关分子标志物的临床应用，肝胆领域的多个专家协会结合中国实际，经过反复讨论于2020年发表了《肝胆肿瘤分子诊断临床应用专家共识》3。该共识将生物标志物分为血清学生物标志物、病理组织学生物标志物及处于探索阶段的血清学生物标志物三类。血清学生物标志物主要包括目前较为成熟、临床应用广泛的AFP、AFP-L3和PIVKA-II等。病理组织学生物标志物主要涵盖了肝细胞抗原-1（HepPar-1）、精氨酸酶-1（Arg-1）、GPC-3及AFP等。陆教授介绍道，由于形态学检查有时难以区分肿瘤来源，免疫组化成为了HCC诊断的重要依据。例如难以鉴别结节与HCC时，GPC-3、热休克蛋白-70和谷氨酰胺合成酶可辅助HCC诊断，即3种免疫标志物中2项呈阳性时患者应被诊断为HCC。另外，处于探索阶段的血清学生物标志物，如ctDNA和miRNA等，由于检测成本较高，且缺乏大规模临床试验结果论证以及组织和肿瘤特异性特征，共识仅建议其作为肝胆肿瘤患者诊断及筛查的参考指标。 

肝癌术后复发转移生物标志物的持续求索之路

陆教授指出，AFP和PIVKA-II是HCC患者术后监测的经典生物标志物。近年研究者逐渐发现一些新型生物标志物也可用于HCC术后复发转移监测，例如术后CTC计数4。一项纳入193例接受肝移植的HCC患者的单中心前瞻性研究显示，术后CTC计数≥1/5ml的患者的累积复发率显著高于术后CTC计数=0/5ml的患者(54.3% vs. 22.9%，p <0.001)，提示术后CTC计数是HCC患者肝移植术后肿瘤复发的预测性生物标志物4。 除了术后CTC计数外，ctDNA、血浆miRNA及HBV PreS区核苷酸变异等新型生物标志物已通过临床研究或回顾性分析初步证实了其在预测术后复发方面的潜力5-7。例如，在2022年的ASCO年会中，一项纳入了74例接受肝移植的HCC患者的初步研究结果显示，与ctDNA阴性组相比，基线ctDNA阳性组与更高的复发率和更短的无复发生存期（RFS）相关。ctDNA的变化与肝移植后的RFS密切相关，ctDNA升高组的RFS差于ctDNA降低组和ctDNA阴性组5。此外，陆教授表示，生物标志物与临床特征（如患者年龄、性别）或肿瘤特征相结合的预测模型也可作为监测HCC患者术后复发转移的工具。 对于百花齐放的生物标志物研发现状，陆教授评价道，目前暂无公认的肝癌术后复发转移的生物标志物，一些新型生物标志物有待大型研究进行验证。如何开发特异性及敏感性较高的监测HCC患者术后复发转移的生物标志物，并降低临床应用成本将是未来研究的重要方向。 

精准治疗时代，走近靶向、免疫治疗相关生物标志物

索拉非尼、仑伐替尼以及瑞戈非尼等药物已获批应用于晚期HCC系统治疗，其主要针对VEGFR、血小板衍生生长因子受体（PDGFR）、成纤维细胞生长因子受体（FGFR）、RAF及MET等靶点8-10。陆教授介绍，在基于生物标志物优化靶向治疗策略方面，研究者们进行了多方的探索。 

图1 HCC常用靶向药物抑制靶点汇总 

虽然目前肝癌一线靶向治疗没有较多可应用临床的生物标志物，但FGF21与EGFR可能成为索拉非尼或仑伐替尼疗效预测的生物标志物。一项研究显示11，基线低FGF21相比基线高FGF21，不论使用索拉非尼或仑伐替尼患者均能有更长的OS。此外，另一项研究发现12，EGFR过表达是仑伐替尼耐药的关键通路，仑伐替尼耐药后使用EGFR抑制剂可为近20%的患者带来获益，提示EGFR可指导仑伐替尼耐药后的治疗选择。 肝癌一线靶向治疗方案最终都不可避免地发生耐药。如何通过疗效预测生物标志物优化二线靶向治疗决策，提高一线治疗进展后患者的获益也是亟需解决的问题。为此，研究者进行了积极的探索。一项回顾性研究提示13，血浆生物标志物中的5种蛋白质( Ang-1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂B、TGF-β1、氧化型低密度脂蛋白受体-1、人巨噬细胞炎性蛋白-1α) 和9种miRNA均可预测瑞戈非尼的疗效，但仍需前瞻性研究进一步证实。另外，卡博替尼疗效预测生物标志物的研究也取得了相应的进展。研究发现MET扩增可增强HCC患者对卡博替尼治疗的敏感性，提示MET扩增可能作为预测卡博替尼疗效的生物标志物14。 在靶向药物不断发展的同时，以阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗（“T+A”方案）为代表的免疫治疗改变了肝癌的治疗格局，显著延长了患者的生存期。但如何探寻良好的生物标志物以有效地预测肝癌免疫治疗的疗效是当前面临的巨大挑战之一。由于各研究结论不一致或研究证据级别较低，传统免疫治疗疗效预测生物标志物，如PD-L1、TMB及MSI等在肝癌免疫治疗中的预测价值尚无定论，无法指导临床选择，仍需要进行进一步的探索。另外，肠道微生物、ctDNA动态监测、免疫亚群动态变化及中性粒细胞淋巴细胞比值（NLR）和血小板淋巴细胞比值（PLR）等其他生物标志物正在积极探索中15-18。研究发现，某些肠道微生态表现可筛选免疫治疗获益人群；ctDNA动态监测可作为 “T+A”方案治疗预后预测的生物标志物；免疫细胞亚群动态变化可作为评估HCC患者免疫治疗有效性的潜在指标；NLR和PLR在PD-1抗体单药治疗过程中具有一定的指导意义，但这只是一个相对的参考范围。因此，NLR和PLR在HCC中的临床指导意义有限。陆教授认为，未来最具前景的免疫治疗生物标志物可能是肠道微生物。目前已有数据显示，肠道细菌和真菌可能对免疫治疗具有一定的指导意义，调节肠道菌群可能成为晚期HCC的重要辅助治疗。一项纳入了10例PD-1抗体耐药的黑色瘤患者的I期研究结果显示，经粪便菌群移植和PD-1抗体治疗后，3例患者取得临床缓解，其中2例患者达到部分缓解，1例患者达到完全缓解。该研究结果支持了“调节肠道微生物菌群可克服免疫疗法耐药”的学说19。 

生物标志物——肝癌新药开发漫漫征途中的”指南针“

生物标志物在抗肿瘤药物研发中发挥着重要作用。陆教授表示，目前肝癌单靶点药物的研发尚无明确结果。FGF19抗体或FGFR4抑制剂可通过抑制FGF19/FGFR4通路，从而为HCC患者带来获益。目前已有多项FGF19抗体、FGFR4抑制剂相关的III期临床研究正在进行中。由于FGF4位点易突变，导致HCC患者对FGFR4抑制剂产生耐药，因此FGF19抗体的开发为临床研究的主要方向。 在靶向药物不断拓展其“疆域”的同时，免疫治疗亦在HCC中探索更多的联合方案。Ib期Morpheus-Liver研究引起广泛关注，该研究在“T+A”方案的基础上添加其他创新疗法，如TIGIT抑制剂、IL-6受体拮抗剂、抗TGF-β抗单克隆抗体或PPARα抑制剂等。另外，该研究还包含PD-1/LAG3双特异性抗体-RO7247669联合贝伐珠单抗治疗方案。不难发现，Morpheus-Liver研究中的治疗方案更为全面地覆盖了HCC免疫治疗热门靶点。 

图2 Morpheus-Liver研究设计 

除了免疫联合疗法之外，研究者还探索了CAR-T疗法在HCC领域的治疗靶点，如GPC3、MUC1及CD276等。一项单臂、I期临床研究结果显示20，6例GPC3阳性HCC患者经GPC3 CAR-T细胞治疗后，ORR为16.7%，DCR为50%。另外，陆教授介绍，一例GPC3 CAR-T治疗原发性肝癌的病例结果显示，GPC3 CAR-T细胞治疗疗效良好，但其PFS较短，仅为2.6个月。MUC1是一种在HCC中过表达的高度糖基化肿瘤相关抗原，一项来自解放军总医院第五医学中心的临床报告显示，双特异性抗体偶联细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）治疗肝细胞癌-胆管癌患者的疗效良好21。CD276作为理想的肿瘤抗原靶点之一22，CD276 CAR-T细胞疗法也可作为HCC治疗的新方向。 此外，一些基于TIGIT、TGF-β、LAG3开发的双特异抗体、三特异性抗体目前均处于临床研究阶段。而溶瘤病毒可作为免疫检查点抑制剂的辅助手段，目前已开展溶瘤病毒用于HCC患者治疗的临床研究。

立足当下，砥砺前行：肝癌生物标志物的未来发展方向

陆教授指出，分子标志物多元化、检测节点动态化以及检测数据模型化是肝癌生物标志物未来发展的主要方向。首先，目前临床上常应用于肝癌的生物标志物多为单一生物标志物，但单一生物标志物无法对肝癌的早期诊断及疗效预测提供精确指导，未来可能从单一诊断生物标志物向多种生物标志物组合发展，以提高检测敏感性和特异性。其次，肿瘤患者的肿瘤微环境及分子标志物状态在整个疾病诊疗过程中会发生变化，因此，单一时间节点的生物标志物检测难以为临床诊疗提供实时信息。未来生物标志物检测可由单一检测时间节点发展为动态检测，以指导患者后续治疗策略。其三，未来还可能将临床特征与分子标志物结合形成多模型预测工具，以期更科学有效地指导HCC患者的全程管理。 除上述发展方向外，陆教授补充道，就生物标志物类别而言，“微观化”及“宏观化”将是其发展的重要方向，即不断探索包含ctDNA在内的小分子生物标志物以及分析免疫细胞功能及免疫微环境状态，以指导HCC精准化治疗。此外，未来探索口腔微生物、肠道微生物等新型生物标志物的变化对疾病或治疗的影响也将是研究的方向之一。