曹彬瞿介明解读：《下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识》

作者：中华医学会呼吸病学分会

通信作者：曹彬，中日友好医院呼吸中心呼吸与危重症医学科 国家呼吸医学中心 国家呼吸疾病临床研究中心 中国医学科学院呼吸病学研究院 首都医科大学呼吸系感染临床诊疗与研究中心；瞿介明，上海交通大学医学院附属瑞金医院 上海交通大学医学院呼吸病研究所，上海市呼吸传染病应急防控与诊治重点实验室

引用本文: 中华医学会呼吸病学分会. 下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识[J].中华结核和呼吸杂志, 2023, 46(4): 1-14. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20220701-00553.

问题1：mNGS 和传统微生物检测方法相比的优势与不足是什么？

传统微生物检测方法技术成熟，可靠性较高，临床应用实践多；mNGS技术理论上能非预设性、一次性检测未知病原，检测范围更广，但存在技术复杂、报告解读困难等不足。与传统微生物学检测方法相比，mNGS的优缺点见表1^［8⁃11］。不同的病原学诊断方法都有其各自的适用场景与前提，需要根据患者群体、病情特点、可疑病原微生物类别、当地实验室条件，选择适宜检测方法。

问题2：哪些疑似LRTI 的临床场景需考虑通过送检mNGS 明确病原微生物？

1. 免疫抑制宿主疑似发生LRTI且临床表现提示非CAP常见病原微生物所致者。免疫抑制宿主包括原发性免疫抑制宿主、进展期恶性肿瘤患者或感染前1年内罹患恶性肿瘤患者（不含Ⅰ期肺癌等早期恶性肿瘤或局限性皮肤癌）、正在接受化疗的恶性肿瘤患者、HIV感染伴CD4+T淋巴细胞计数<200/μl、实体器官移植受者、造血干细胞移植患者、长期使用较大剂量糖皮质激素治疗患者（等效泼尼松≥20 mg/d且持续≥14 d，或等效泼尼松累积剂量>700 mg）、接受生物免疫调节剂治疗患者［如抗肿瘤坏死因子（TNF）⁃α单克隆抗体等］、接受缓解病情抗风湿药或其他免疫抑制药物（如环孢素、环磷酰胺、甲氨蝶呤等）治疗的患者、各种原因导致的粒细胞缺乏患者（外周血中性粒细胞计数<0.5×109/L）等^{［12⁃13］}。

2. LRTI患者发病初期即出现需要使用血管活性药物的感染性休克、需要有创机械通气的呼吸衰竭、多脏器功能不全等危及生命的状况时；LRTI经规范经验性抗感染治疗48~72 h后，感染症状仍持续加重或影像学快速进展者。

3. 聚集性发病疑似具有传染性、但无法明确病原体的LRTI；有特殊病史（如近期境外或野外旅游史）且经验性治疗无效，病情较为严重的LRTI；临床考虑特殊病原体（如钩端螺旋体、嗜肺军团菌、鹦鹉热衣原体等）感染且病势迅疾或迁延者，常规培养困难或所在医疗机构无法提供可靠的传统检测方案时。

4. 患者有LRTI症状或影像表现，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程迁延，需鉴别是否由非感染性疾病所致（如结缔组织疾病的肺部累及、肺淋巴瘤等），可以在常规病原微生物检测、感染生物标志物、病理等相关检查同时送检mNGS以帮助鉴别诊断。

问题3：哪些临床场景通常不建议送检mNGS？

1. 免疫功能健全宿主罹患LRTI（包括重症肺炎），经过规范的经验性抗感染治疗病情已好转。

2. LRTI已通过其他方法获得病原学结果，与临床特点相符，或针对性治疗有效。

3. 无法获取优质标本。

问题4：如何根据所在医院微生物检测能力差异化送检mNGS 诊断LRTI？

mNGS技术本身具有价格昂贵、技术复杂、结果解读难度大的特点，不建议mNGS替代传统生物检测。在传统微生物检测能力不足的医疗单位，对于疑难、复杂或危重感染病例，可以考虑将mNGS作为传统的补充手段。原则上应首先针对可疑病原微生物选择可靠的检测方法，包括PCR等特异性的分子检测，但在缺乏相应检测手段的情况下，可将mNGS作为备选。例如，疑诊病毒性肺炎或非典型病原体肺炎患者，应首选针对常见呼吸道病毒和非典型病原体的PCR 或多重PCR 和（或）抗原检测，在常规检测阴性或本机构无法进行相关检测时，可将mNGS作为重症患者的选择。

问题5：如何根据LRTI 特点选择mNGS 送检标本类型？

在LRTI的病原微生物诊断中，可用于mNGS检测的标本包括痰（含诱导痰）、气管吸引物、支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluids，BALF）、经支气管肺活检（transbronchial lungbiopsy，TBLB） 标本、经支气管内超声（endobroncheal ultrasonography，EBUS）活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等^{［14⁃19］}。选择mNGS送检标本类型时应考虑下列因素：（1）标本中的病原微生物载量；（2）标本中污染或定植微生物的含量及其对检查结果的干扰；（3）标本中人源序列的含量及其对检测结果的干扰；（4）标本采集的难易程度及相关操作风险；（5）标本采集所需要的医疗费用。表2比较了常用呼吸道标本的临床适用场景。

问题6：样本质量如何保证，标本保存和运输条件是什么？

1. 保证mNGS送检标本质量的主要措施：mNGS在采集、运输、保存等多个环节易污染，影响结果判读。（1）选择高质量的呼吸道标本，标本采集时应尽量避免污染。（2）尽量由专门技术人员进行采集，可参考临床微生物分子检测规范，对医护人员进行采集运输微生物标本等方面的培训。（3）规范采集方法和送检流程：对于痰液标本采集，医护人员应首先判断患者是否有自主咳痰的能力，监督并协助患者，清水漱口2~3次，用力咳出深部痰3~5 ml，保存在无菌杯内；若为气管插管患者，无法自主咳痰，可通过气管插管进行抽吸，留取标本在无菌杯内；BALF标本采集，应在支气管镜的引导下，使用无菌生理盐水多次灌洗，留取5~10 ml标本放入无菌管中，尽快送至检测实验室；肺组织标本采集，应尽量对感染部位或边缘进行取材，保存在无菌杯中，尽快送至检测实验室。尽可能在首次抗菌药物使用或更改治疗方案前进行采集。尽量使用有螺口的无菌杯或使用封口膜进行密封，减少运输和保存过程中的污染。（4）信息标注完整：患者基本信息，临床症状（包括现病史和既往史等），标本采集时间、方法，抗菌药物使用种类及其持续时间，临床医生的初步诊断及对致病微生物的初步判断等。（5）针对不同的标本类型，制定标本接收或拒收标准。如合格的痰标本应白细胞>25个/低倍视野，鳞状上皮细胞<10个/低倍视野，或白细胞/鳞状上皮细胞>2.5；合格的BALF标本鳞状上皮细胞应<1%，镜检现场评价有助于提高采样质量。实验室在接收到标本后，应尽快评估标本质量。对于不合格的标本，应与临床沟通后尽量重新采集。若重新采集难度较大，则在相应标本的检测结果中应明确标注标本质量不合格，在对该标本的测序结果进行判读时应考虑标本质量对检测结果的干扰。

2. mNGS 送检标本的保存要求：（1）下呼吸道标本：包括痰（含诱导痰）、BALF、肺炎旁胸腔积液等，原则上应在采集后立即送检。若标本不能立即送检，标本采集时间与检测时间间隔≤24 h，可在2~8 ℃保存。若标本采集时间与检测时间间隔>24 h，DNA测序标本保存时间≤2周时可储存在-20 ℃冰箱，保存时间超过2周则需储存在-80 ℃冰箱；需要进行RNA测序的标本如果保存时间>24 h，均应保存在-80 ℃冰箱。对于短期不做检测的液体样本，冻存前应分装保存在冻存管（≥500 μl/管）中。（2）血标本：采集后4 ℃保存不超过8 h，如果需要长期保存，分离血浆后4 ℃可保存24 h，长期保存于-80 ℃冰箱。（3）组织标本：来自感染部位的穿刺或手术切除组织标本，应保存在无菌生理盐水或者Hank′s液中，4 ℃保存不超过24 h。如果需要长期保存，小块组织可以不加保存液立即-80 ℃冻存，穿刺活检标本置于无菌生理盐水-80 ℃冻存。

3. 标本的运输要求：（1）24 h内送抵实验室并开始检测，可考虑冰袋低温运输；（2）24~72 h内送抵应干冰运输，送抵后应立即进行标本前处理和核酸提取。

4. 需要进行去宿主核酸处理的标本保存和运输注意事项：除了上述注意事项外，此类标本一般要尽量保证病原微生物完整性，避免碾磨或多次冻融。

问题7：哪些LRTI 需要在进行DNA测序的同时送检RNA测序？

RNA病毒（附表1）引起的LRTI通常有一定的季节性、流行性或地域性。建议检测方法首选单重或多重PCR检测或相应的抗原检测^{［20⁃21］}。若当地医疗机构无相应检测能力，或PCR检测阴性但依然高度怀疑时，可在送检mNGS DNA测序的同时进行RNA测序。下列临床情况可供参考：（1）呼吸道RNA病毒感染流行季节（主要是冬春季节以及南方的夏季）、有相应流行病学史的患者出现疑似呼吸道病毒感染的临床和（或）影像表现。（2）LRTI合并以下情况时：免疫抑制宿主；发热伴严重血小板减少或凝血功能障碍；急性肝肾功能损害；急性神经系统症状。

问题8：mNGS 检测报告需要关注哪些内容？

mNGS 检测报告从检测技术角度应包括如下内容：标准化后的微生物特异性读长（reads）数/序列数、标准化中英文名称、相对丰度、阈值、基因组覆盖度图。可选内容有：相应部位病原微生物列表、微生物序列与人源核酸序列的比值、测得总序列数、质量合格序列数、可比对至微生物数据库序列数、测序质控图、耐药基因、毒力基因等。

报告微生物的版块可按细菌、病毒、真菌、寄生虫、特殊病原体（支原体、衣原体、立克次体等）5大类分别列举。

主要参数定义及其意义：（1）reads：测序仪单个测序反应所得到的碱基序列，二代测序平台一般长度为50~75 bp的片段。（2）reads数：指测序获得的某种微生物属/种碱基序列的数量。病原微生物属/种水平上检出的reads数与当次实验的总测序数据量直接相关，为避免总测序数据量高低的干扰，应对检出reads 数进行标准化之后进行报告。（3）覆盖率：指达到给定深度的测序碱基占整个基因组或目标区域的百分比。没有达到给定深度的部分称为盲隙（gap）。通常同时使用覆盖率和深度描述测序结果。覆盖度图采用病原全基因组模式图的形式，展示病原检出位点及检测次数的分布情况。测序深度指测序得到的碱基总量与基因组大小的比值，或可理解为基因组中每个碱基被测序到的平均次数。（4）相对丰度：指除去宿主序列之后，某微生物序列在相应5大类微生物类别中的分布比例。丰度越高，表示该微生物所占比例越高。它只能指示同一样本中某微生物的相对数量，不能用于不同样本之间的比较。（5）Q值：指质量分值，用于衡量测序准确度，公式为Q=-10log10P，其中 P 代表该碱基被测序错误的概率。如Q20表示该碱基检测错误的概率为1%。（6）RPM：每一百万条测得序列包含的阳性reads 数（reads per million）。（7）RPTM：每一千万条测得序列包含的阳性reads数（reads per ten million）。

问题9：mNGS 检测结果用于LRTI 病原学诊断时应遵循何种流程和路径？

1. 分析报告质量，判断结果可信程度：根据送检标本类型、报告形式及内容判断检测结果是否规范可信。

2. 对mNGS 检测出的微生物进行分级：参照附表1判断mNGS检出的微生物为致病性微生物、条件致病微生物还是定植微生物。致病性微生物在肺内定植可能性低，阳性结果多考虑为导致感染的病原。条件致病微生物需结合患者的宿主因素、血液理化指标和影像学特征、抗感染药物用药史及治疗反应、传统微生物学检测结果综合分析进一步判断是否致病。定植微生物引起LRTI 的可能性低，多不考虑致病，但吸入性肺炎、肺脓肿、脓胸等混合性感染时，口腔定植微生物也可能致病。经皮穿刺肺活检标本或胸腔积液标本检出的皮肤定植微生物，通常不致病。遇到不熟悉的微生物，可借助病原检索工具https：//www. chinapneumonia.cn/pathogens查询其在既往感染性病例中的报道。

3. 根据临床特征，结合mNGS微生物分级进行临床决策（图1）：如确定为致病病原体（注：此处致病病原体为临床决策后的微生物分级，不同于上文致病性微生物），可根据该结果进行针对性治疗。如判断为可能致病病原体，则需评估患者病情状况：危重症患者，可结合临床特征先根据mNGS结果调整抗感染方案，同时寻求其他支持证据（如临床微生物室涂片/培养结果、抗原/抗体检测结果、PCR检测结果等）综合判断其致病的可能性和进行针对性治疗的必要性；非危重症患者可先寻求其他支持证据，再调整治疗方案。

4. mNGS阴性结果的临床决策：若mNGS结果为阴性，但综合临床特征，仍强烈怀疑为感染性疾病，则建议对报告中的背景微生物、原始数据列表或其他病原微生物检测结果进行分析（图1）。若临床特征支持非感染性疾病，应对原发疾病进行诊治。

5. 组织多学科会诊（multi⁃disciplinarytreatment， MDT）：若经过以上流程，仍无法确认致病病原体，可组织MDT讨论。

6. 经验总结：鉴于mNGS 用于诊断LRTI 尚缺乏充分的循证医学证据，因此，临床医师在使用每一例报告后应进行回顾性分析总结，积累临床经验。

问题10：如何对mNGS 检测报告的微生物进行致病概率分级？

根据微生物在下呼吸道的致病性特征，初步分为致病性微生物、条件致病微生物和定植微生物（附表1）。条件致病微生物的判断需要结合患者的宿主因素、血液理化指标和影像学特征、抗感染药物用药史及治疗反应、传统微生物学检测结果综合分析。

免疫抑制宿主发生机会性感染的风险更高，病原微生物包括肺孢子菌、分枝杆菌属、诺卡菌属、曲霉属、毛霉目、隐球菌属、巨细胞病毒（CMV）、铜绿假单胞菌等^{［22⁃24］}。免疫正常宿主LRTI按照起病场所分为社区起病^{［25⁃27］}和医院起病^{［28⁃29］}。社区起病的LRTI应排查流行病学和特定病原微生物的接触史，如疫区、传染源、禽类、蝙蝠等接触史，应考虑到结核分枝杆菌、禽流感病毒、隐球菌属、组织胞浆菌属等病原微生物。较长时间的抗感染治疗会影响病原微生物检出^{［30⁃32］}，经验性治疗失败后应尽快完善检查并需要考虑未能有效覆盖的病原微生物。

常用于辅助LRTI判断推测感染病原体的理化项目包括：血常规及外周血细胞分类、降钙素原（procalcitonin，PCT）、C 反应蛋白（C reactiveprotein，CRP） 、红细胞沉降率（erythrocytesedimentation rate，ESR）等，部分特殊感染还可能影响肝肾功能、凝血功能；其他理化指标如肿瘤标志物、自身抗体谱、免疫球蛋白、补体等常用于与非感染性疾病的鉴别诊断。

胸部影像学改变方面，大多数病原微生物都可导致肺实变，如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、腺病毒等^{［33⁃34］}。肺部结节伴空洞形成常由真菌导致，如曲霉属、毛霉目、隐球菌属等；也可以见于金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、放线菌属、诺卡菌属引起的感染。弥漫性磨玻璃样病变主要见于肺孢子菌、肺炎支原体和病毒（如CMV、流感病毒等）^［35］。

mNGS 检测结果的解读必须结合常规微生物实验室检测，包括但不限于涂片和培养、特殊染色、γ⁃干扰素释放实验、单重/多重PCR或一代测序等分子生物学检测，真菌G试验、GM 试验、曲霉IgG抗体、寄生虫血清特异性抗体、隐球菌荚膜多糖抗原，肺炎链球菌、嗜肺军团菌尿抗原检测等。

问题11：如何根据mNGS 阴性报告作出临床决策？

mNGS可能出现阴性结果，即未报告明确病原体。对此应结合临床和常规微生物实验室检测结果，综合判断是真阴性还是假阴性（图1）。

真阴性指患者肺内病灶并非是感染性疾病所致，如弥漫性间质性改变可能为结缔组织疾病肺累及或其他弥漫性实质性肺疾病（diffuse parenchymal lung disease，DPLD）。

假阴性是指未能检出感染致病微生物。通常见于以下情况：（1）技术原因而导致的假阴性，例如部分呼吸道病原微生物外壁很厚或脂质成分高^{［36⁃37］}，核酸提取过程中难以破壁，致核酸未彻底释放，如曲霉属、毛霉目、隐球菌属和诺卡菌属、分枝杆菌属等［38⁃39］；标本储存或者运输问题致样本核酸降解，如流感病毒等RNA 病毒易出现该情况；（2）所使用的数据库不全，导致检出病原微生物序列未准确注释；（3）生信分析错误而致漏报致病微生物；（4）标本中人源核酸过高；（5）样本中病原微生物载量低于mNGS最低检测下限，或测序数据量太低未能覆盖到该病原微生物［40］，例如已接受有效抗微生物药物治疗而导致病原微生物负荷显著降低而难以被检出；（6）采样不规范或标本类型不合适（详见问题13）等。当mNGS 回报阴性结果时，临床仍不能排除LRTI，临床医生应进一步详尽了解病史、发病特点及诊疗经过及治疗反应，结合影像学特点，反复送检常规病原学检查，必要时可送检不同部位标本（如BALF、血、肺组织等）进行mNGS检查，并动态评估患者对抗感染治疗的反应以协助进一步明确疾病类型。

问题12：mNGS 报告中出现多种病原微生物如何解读？

mNGS检测中出现多种病原微生物时，推荐首先通过显微镜检查、培养、抗原、PCR等方法确认，并结合临床特征解读。必要时可通过不同部位标本mNGS检测结果进行相互印证。

mNGS可在一份标本中检测到多种微生物，当出现以下情况时，考虑其中一种或多种微生物为假阳性结果：（1）标本质量不合格；（2）标本采集、送检过程受呼吸道定植菌、皮肤定植菌、环境菌、工程菌的污染；（3）检测过程中背景菌的质量控制不严格；（4）患者的职业和生活环境、基础疾病、临床特点和影像特征与检出的微生物不相符；（5）无法用其他微生物学方法验证；（6）治疗反应和疾病转归与检出的微生物不相符。

以下临床场景多支持mNGS检出的多病原微生物为真阳性结果：（1）误吸风险或明确误吸史的患者，出现多种常见口腔定植菌，需考虑吸入性肺炎/肺脓肿。此类病例常可同时在下呼吸道标本涂片和（或）培养中检出相应的混杂菌群。（2）CAP患者有时会出现细菌、非典型病原体、呼吸道病毒等混合感染^{［41⁃42］}。（3）免疫缺陷宿主LRTI常发生细菌、真菌、病毒、分枝杆菌等病原微生物的混合感染。

问题13：标本类型对解读mNGS 报告有什么影响？

1. 痰（包括诱导痰）、气管吸引物、BALF及各种经支气管肺活检标本：（1）易受口腔或上呼吸道常见定植微生物的污染，主要包括念珠菌属、链球菌属、葡萄球菌属、奈瑟菌属、厌氧菌等。（2）BALF标本中致病微生物的载量通常较高，受非致病微生物和人源核酸的干扰较小，当疑似感染部位BALF标本的mNGS检测结果为阴性时，虽然不能据此完全排除感染^［18］，但可作为排除感染的重要依据，应结合临床表现、肺部影像表现、抗感染治疗反应及其他病原微生物检测结果重新审视感染的诊断是否正确。（3）经支气管肺活检标本通常组织块较小，有时可能来自于感染周边的反应性炎症区域，致病微生物的载量可能较低，同时人源核酸占比高，检测结果受的干扰较大，所以其阴性结果并不能排除感染^{［18， 38， 43］}。

2. 胸腔积液与肺组织标本：（1）经皮穿刺标本易受皮肤定植微生物或环境微生物污染，如表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、耻垢杆菌、丙酸杆菌等。（2）经皮肺穿刺活检标本通常组织块较小，有时可能来自于感染周边的反应性炎症区域，致病微生物的载量可能较低，同时人源核酸占比高，检测结果受的干扰较大，因此其阴性结果不能排除感染^{［18， 38， 43］}，但如果mNGS的送检标本为大块的外科手术活检或切除标本，其阴性结果应该可以作为排除感染的重要依据；（3）脓胸中虽然致病微生物的载量较高，但也同时存在大量的炎症细胞，人源核酸占比高，mNGS检测过程中的去人源核酸操作可能导致检测结果呈假阴性。

3. 血液：（1）正常人的血液中可能存在皮肤、肠道或上呼吸道定植微生物死亡后崩解产生的微量核酸片段，血液检出致病微生物序列不代表该病原微生物来自呼吸道，也可能来自肠道或者其他部位。（2）血液标本检出CMV、EB 病毒等DNA 病毒时，只能说明血液中存在病毒核酸，是否存在病毒性肺炎需要结合临床表现、肺部影像表现和下呼吸道标本的检测结果综合判断。（3）血液标本中致病微生物的载量往往较低，而且检测结果受人源核酸的干扰较大，其阴性结果不能排除感染^{［18， 38， 43］}。（4）血浆微生物mNGS 与其他体液mNGS 不同，是无细胞的游离DNA（cell⁃free DNA，cfDNA）测序，在去除血细胞的过程中可能导致胞内病原体（如立克次体、衣原体等）被同时去除，因而某些胞内致病微生物感染可能出现假阴性，可考虑对血细胞层进行mNGS检测。

问题14：mNGS 报告中低reads 数微生物如何解读？

1 . mNGS报告一些病原微生物的reads数低时，应从以下几个方面加以考虑：（1）某些病原微生物的核酸提取效率低和（或）标本中该病原载量较低；（2）采样、运输和实验过程中引入污染可能，结合临床分析之后，若考虑此低reads微生物不是致病微生物，应考虑污染或者假阳性结果；（3）生信分析中出现假阳性结果。

2. 临床医生应结合患者临床表现、影像学、常规微生物学检测结果，综合判断该低reads病原微生物的临床价值。如果怀疑此微生物感染，条件允许时采用另一方法验证。检测出低reads病原微生物无法用临床微生物常规方法进行验证时，可要求检测方提供该微生物原始数据，直接与高质量的参考基因组比对，如果此病原微生物意义重大，条件允许，也可以自行设计PCR 引物或一代测序等验证。（1）某些微生物核酸提取效率较低，致其检出reads数少，例如，BALF mNGS测出少量结核分枝杆菌的reads，应关注Xpert MTB/RIF是否阳性；BALFmNGS测出少量新型隐球菌的reads，应关注外周血或BALF 隐球菌荚膜多糖抗原检测结果；BALFmNGS 测出少量曲霉菌的reads，应关注BALF GM和（或）曲霉菌属IgG抗体结果；（2）血浆cfDNA 测序对于胞内病原体（如立克次体、衣原体等）测得的reads往往较低；（3）如果血或呼吸道标本mNGS报告低reads 数的病毒，应关注PCR 检测结果；（4）BALF报告某些易培养的细菌低reads数，应关注BALF细菌培养的结果；（5）血浆mNGS报告一些低reads数微生物时，有可能是其他部位的感染，微生物被抗菌药物、人的免疫细胞裂解后释放出游离核酸，循环入血后被核酸外切酶裂解成小片段的cfDNA，也可能是其他部位定植的微生物，例如造血干细胞移植患者往往肠道屏障受损，可从血浆mNGS中检测出低reads数的部分肠道微生物。

3. 对于难以确定临床意义的低序列数微生物，必要时可进行MDT讨论。

问题15：根据mNGS 报告结果，何种情况下应该考虑追踪mNGS 检测的原始数据列表？

mNGS检测结果报告还存在一定的漏报比例，尤其是胞内感染或破壁困难的病原微生物、临床少见的病原微生物。检测报告发现的这些病原微生物信号偏低，且和阴性对照检出的序列数相当时，实验室可能会考虑不报告。因此，如果临床上根据患者的病史、影像学和常规实验室检查仍然高度怀疑感染性疾病，质疑mNGS 报告给出的检测结果时，可以考虑向检测实验室追踪检测结果的原始数据列表，结合临床资料在其中查找可能的病原微生物。

问题16：LRTI 病原诊断中耐药基因、毒力基因意义如何？

mNGS可提供耐药基因与毒力基因，但受限于序列读长和测序深度，尚有一定局限性：（1）对于如水解酶等耐药机制，难以获得基因全长序列，不能深入分析耐药基因亚型。（2）基因点突变是病毒（如CMV、流感病毒等）和结核分枝杆菌等常见的耐药机制，需要足够的测序深度和精准度，才能检出相关基因突变，预测耐药信息。（3）mNGS结果易受标本类型及质量等因素影响。检出多种微生物时，耐药与毒力基因难以精准匹配到具体微生物。（4）难以确定耐药或毒力基因型与其表型的一致性，即mNGS检测获得的基因信息只能定性地提示致病微生物可能具有某一种耐药机制，但无法确定该耐药基因是否表达，也无法得出药敏表型。（5）耐药基因与毒力基因仅占病原微生物全基因组的一小部分，检测敏感度有限，假阴性率高。因此，应谨慎解读mNGS中耐药基因和毒力基因的检测结果。

问题17：如何结合mNGS 报告组织疑难LRTI MDT？

1. 针对疑难LRTI病例的会诊，建议由医务部门或相关科室，组织呼吸与危重症、感染、临床微生物、临床药学等专业人员共同参与^［44］。必要时可以扩大会诊参与范围，如特殊部位考虑对应专科，特殊年龄考虑儿科、老年病、感染控制等专科，特殊情况考虑病理、影像等，必要时邀请熟悉mNGS试验流程的生信和技术人员参加。会诊应立足临床信息，并围绕mNGS报告及其他微生物检验结果进行解释，对相应感染进行判断，对进一步处置和感染控制给出建议。

2. 如mNGS报告检出具有公共卫生安全隐患或国家法定传染病的病原微生物时，应严格按照国家传染病法规和院内传染病防控管理要求，对患者及接触患者的会诊人员、患者标本综合处置，严格执行隔离与上报制度。

与常规下呼吸道病原微生物检测方法相比，mNGS的规范应用可高效、准确、全面地识别病原微生物，有助于感染性疾病的早期诊断，也可以对病原微生物进行快速流行病学分析，确定潜在的传播链^［45］。但是，mNGS技术上存在局限性，如假阳性率高、部分胞内菌或厚壁微生物检出率低；在LRTI临床应用方面尚无统一标准，循证医学证据不足^{［17， 46］}。由于这些问题的存在，当前mNGS可作为LRTI常规临床微生物检测技术的补充。本共识的重要意义在于，通过确定标准规范的样本采集、数据分析和临床解读流程，促进mNGS合理用于LRTI临床实践，同时指导开展临床研究获得一批高质量的循证医学证据，为下一版共识提供更多的依据。通过mNGS临床应用经验的不断积累，未来目标是使mNGS 检测流程标准化、检测方法同质化、数据解读生物信息库标准化，从而为感染性疾病的诊断提供更加专业的指导。