维奈克拉与吉瑞替尼产生高度协同作用，可有效治疗FLT3野生型高危急性髓系白血病

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急性髓系白血病（AML）多发于老年人群，中位发病年龄为65岁，且老年患者不适合强化化疗。最近有研究证实，在去甲基化药物（HMA）或低剂量阿糖胞苷（LDAC）的基础上加用BCL-2抑制剂——维奈克拉提高了患者的缓解率。因此，美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准HMA联合维奈克拉治疗不适合强化化疗的新诊断AML患者。尽管如此，仍有部分AML患者未达到缓解，且大多数患者在最初接受维奈克拉联合阿扎胞苷治疗达到缓解后复发。复发患者对目前的所有治疗均耐药且通常在短时间内死亡。目前缺乏与维奈克拉联合用药时产生协同作用且有效的药物评估。

最近的一项研究表明，在对维奈克拉耐药的AML细胞中观察到抗凋亡BCL-2家族成员MCL-1或BCL-XL水平的升高。然而，MCL-1抑制剂对正常组织有严重毒性的风险，尤其是心脏毒性。但间接靶向MCL-1的药物联合BCL-2抑制剂可能是一种有前景的治疗方法。为了确定比维奈克拉联合阿扎胞苷更有效的联合治疗，提出了多种治疗选择，包括抑制PI3K、CDK、SMAC或复合物I。研究者采用靶向髓系恶性肿瘤相关通路的高通量离体药物扰动实验来确定治疗高危AML方案中与维奈克拉联合效果最好的药物。

高通量药物筛查确定高危AML的维奈克拉的联合治疗药物

本研究采用维奈克拉联合靶向髓系恶性肿瘤相关通路的药物进行了高通量离体药物扰动实验（图1A）。将来自高危AML患者的31份样本与维奈克拉（0、1和20nM）和5种浓度的64种药物共同培养。为了评估离体药物筛选平台的可靠性，本研究根据所有AML样本中药物反应谱的相似性对靶向各种通路的药物进行了汇总。

筛选结果显示，与维奈克拉产生协同作用且有效的前3种药物为MIK665（MCL-1抑制剂）、OTX015（BET抑制剂）和吉瑞替尼（FLT3抑制剂）（图1B）。MIK665与维奈克拉联合效果最好，但有研究表明抗凋亡蛋白MCL-1会使AML患者对BCL-2抑制疗法产生耐药。OTX015通过降低MCL-1水平与维奈克拉产生协同作用。本研究的筛选方法进一步确定了吉瑞替尼为维奈克拉的高活性联合药物（图1B）。试验结果如预期，吉瑞替尼在FLT3突变AML中的单药治疗效果高于FLT3野生型AML（P=0.075；图1C）。然而，维奈克拉联合吉瑞替尼在FLT3野生型中的协同作用强于FLT3突变AML（P=0.0427；图1C）。与维奈克拉的协同效应仅限于吉瑞替尼，在其他FLT3抑制剂如奎扎替尼、米哚妥林或索拉非尼中未观察到（图1D）。值得关注的是，在TP53突变患者亚组中，吉瑞替尼联合维奈克拉的疗效最好（图1E），据报告，HMA或LDAC联合维奈克拉治疗的缓解率较低。在首次诊断时无FLT3-ITD但伴TP53突变的患者结果显示吉瑞替尼与维奈克拉高度协同，而其他标准治疗方法与维奈克拉无协同作用或协同作用较弱（图1F）。

综上所述，研究数据确定吉瑞替尼联合维奈克拉在伴FLT3野生型和TP53突变的高危AML中具有高度协同作用。

蛋白质组学分析显示在维奈克拉耐药的AML中FLT3信号通路上调

研究者根据维奈克拉和阿扎胞苷的药物筛选离体反应和荧光激活细胞分选和质谱分析选择了6个原发性FLT3野生型样本（图2A）。根据协同评分，2个原发性样本对维奈克拉和阿扎胞苷敏感，4个原发性样本对维奈克拉和阿扎胞苷不敏感（图2B）。对维奈克拉-阿扎胞苷不敏感的AML样本富集了FLT3通路活性相关蛋白（例如，RAF/MAP、FLT3和MAPK1/MAPK3；FLT3信号转导的标准化富集评分，1.83；校正P=0.0001；图2C-D）。结果表明，在FLT3野生型AML中，FLT3信号通路上调与维奈克拉-阿扎胞苷耐药相关。

在FLT3野生型AML中，维奈克拉-吉瑞替尼可降低细胞活力和集落形成能力并诱导细胞凋亡

用指定浓度的维奈克拉-吉瑞替尼方案处理FLT3野生型HL60细胞（经处理已耐药维奈克拉-阿扎胞苷）和OCI-AML2细胞的剂量反应试验结果显示，在患者可达到的血药浓度下，48小时后细胞活力下降（图3A）。细胞活力降低与细胞凋亡增加相关（图3B-C）。此外，联合用药协同降低了3种FLT3野生型AML细胞系的集落形成能力（图3D-E）。

维奈克拉-吉瑞替尼联合给药抑制ERK和GSK3A/B磷酸化，并诱导MCL-1的蛋白酶体降解

与未处理或单药处理的细胞相比，维奈克拉-吉瑞替尼组的细胞中MCL-1蛋白表达降低（图4A）。维奈克拉-吉瑞替尼方案除了降低MCL-1水平外，还降低了GSK3A/B磷酸化水平（图4B）。进一步观察到接受维奈克拉-吉瑞替尼联合用药后，MCL-1 T163磷酸化水平降低，MCL-1 S159磷酸化水平升高，而单药治疗组没有，pT163水平降低和pS159水平升高与总MCL-1水平降低相关（图4C），提示MCL-1的蛋白酶体降解。吉瑞替尼单药或联合给药处理的细胞中的蛋白酶体抑制后MCL-1水平增加（图4D）。

MCL-1 S159A突变细胞对维奈克拉-吉瑞替尼无应答

研究者试图通过慢病毒过表达MCL-1 S159A突变来确认S159磷酸化对维奈克拉-吉瑞替尼疗效起关键作用（图5A）。MCL-1 S159A过表达的细胞对维奈克拉的耐药性增加（图5B）。维奈克拉-吉瑞替尼联合用药未产生协同作用，MCL-1 S159A细胞对联合用药耐药（图5C-D），强调了MCL-1降解对维奈克拉-吉瑞替尼疗效的重要性。

在体内PDX模型试验中，维奈克拉-吉瑞替尼联合给药降低了FLT3野生型TP53突变的植入

研究者给小鼠注射了肿瘤细胞，以分析维奈克拉-吉瑞替尼的体内疗效。因为药物筛选表明TP53突变的AML活性最高，所以选择TP53突变的FLT3野生型模型。将小鼠分为4个给药组：维奈克拉组、吉瑞替尼组、维奈克拉-吉瑞替尼组和对照组（图6A）。在给药第4周内，分析移植成活率。维奈克拉-吉瑞替尼组中观察到的移植成活率最低，与对照组的移植成活率水平存在显著差异（P=0.0308，图6B）。维奈克拉-吉瑞替尼组有效治疗FLT3野生型TP53突变AML。

维奈克拉-阿扎胞苷治疗后复发/难治的AML患者接受维奈克拉-吉瑞替尼产生缓解

研究者治疗了4例复发/难治性FLT3野生型AML患者，所有患者既往均接受过异基因造血干细胞移植。2例（#02和#70）患者经维奈克拉-阿扎胞苷治疗后复发。患者#03在第二次复发后对维奈克拉-阿扎胞苷以及包括高剂量阿糖胞苷的联合方案具有前期难治性。患者#02接受维奈克拉-吉瑞替尼治疗后，中性粒细胞绝对计数和外周血原始细胞清除率升高，骨髓原始细胞从53%降至30%（图6C-D）。患者#70接受维奈克拉-吉瑞替尼治疗导致外周原始细胞减少和中性粒细胞绝对计数升高至>1.0/nL（图6C，6E）。患者#03接受联合治疗导致骨髓原始细胞从70%降至40%（图6F）。患者#05在15个疗程的维奈克拉-阿扎胞苷治疗后复发，骨髓穿刺显示原始细胞计数为8%，而NPM1水平升高至286%。维奈克拉-吉瑞替尼治疗3周后，骨髓穿刺显示细胞学完全缓解伴计数不完全恢复，NPM1水平降至81%（图6G-H）。值得注意的是，在维奈克拉-吉瑞替尼治疗期间，患者#70的原始细胞中MCL-1强烈耗竭，患者#02的原始细胞中MCL-1轻微减少（图6I）。患者#01的骨髓原始细胞在接受维奈克拉-吉瑞替尼治疗后MCL-1蛋白水平受到抑制（图6J）。

患者对维奈克拉-阿扎胞苷产生耐药性与MCL-1和FLT3下游通路上调相关

HL60细胞通过持续接受浓度递增的维奈克拉-阿扎胞苷治疗产生耐药（HL60R）（图7A）。HL60R细胞表达高水平的MCL-1（图7B）。吉瑞替尼和维奈克拉-吉瑞替尼降低细胞活力并抑制HL60R的集落形成能力（图7C-D）。亲代HL60和HL60R细胞的蛋白质组分析显示，在维奈克拉-阿扎胞苷耐药细胞中，几个FLT3下游信号通路上调。FLT3信号转导以及MAPK信号转导相关蛋白在HL60R中富集（图7E-F）。

研究结论

总体而言，维奈克拉-吉瑞替尼在FLT3野生型原发性高危AML样本中具有协同作用。值得注意的是，联合治疗降低了既往接受多线治疗且无其他治疗选择的FLT3野生型患者的原始细胞计数。考虑到研究中的患者已到疾病晚期，目前未得到更多的结论，因此需要进行更多的临床试验来评估维奈克拉-吉瑞替尼治疗FLT3野生型AML患者的疗效。合理的体外药物试验为进一步改善基于维奈克拉的AML治疗方案开辟了新途径。

参考来源

Maike Janssen, Christina Schmidt, Peter-Martin Bruch, et al. Venetoclax synergizes with gilteritinib in FLT3 wild-type high-risk acute myeloid leukemia by suppressing MCL-1. Blood. 2022 Dec 15;140（24）:2594-2610. doi: 10.1182/blood.2021014241.