马杰教授：新时代下，融合基因检测应如何为非小细胞肺癌患者精准治疗领航

肿瘤的精准诊断是精准诊疗的基础。为提升临床医生的精准诊断观念，医脉通肿瘤科推出了《精准肿瘤，诊理匠心》病理专家访谈栏目，希望通过病理大咖深度访谈，阐述规范化诊疗流程，助力肿瘤精准诊疗。本期访谈将聚焦于融合基因的规范化检测。融合基因是非小细胞肺癌（NSCLC）中非常重要的基因变异类型，多项临床研究指出，携带融合基因的患者可从相应的特异性靶向治疗中获益，如“钻石突变”ALK融合、ROS1融合等。融合基因检测方法多且复杂，因此，融合基因检测规范化势在必行。值此之际，医脉通特邀河南省肿瘤医院马杰教授分享当前融合基因靶点药物的新进展以及融合基因的检测策略。

Q1. 近十多年来，分子诊断的普及及靶向药物的应用大幅提升了NSCLC驱动基因阳性人群的获益，其中融合基因是NSCLC驱动基因变异的重要形式，能否请您谈谈，目前NSCLC有哪些融合基因靶点药物新进展？

融合基因是指两个不同基因的部分或全部序列相连形成的新混合基因，其编码产生的融合蛋白能够介导肿瘤的发生发展。基因融合是NSCLC中一类重要的分子变异，在NSCLC中的发生率为8%~12%，近十余年来，针对融合基因的靶向治疗进展迅速，已有多种针对不同基因融合的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）获批用于临床治疗，融合基因阳性的晚期NSCLC患者可从相应靶向治疗中显著获益¹。NSCLC中的融合基因包括ALK、ROS1、RET和NTRK等，目前我国已有多个特异性融合靶点TKI药物获批。

ROS1基因融合是一种独特的受体酪氨酸激酶，与ALK同属胰岛素样受体酪氨酸激酶超家族成员，二者氨基酸序列上具有近49％的相似性，在激酶催化区的ATP结合位点同源性高达77％，且在临床特征上也非常相似。ROS1基因融合在NSCLC中的发生率为1.0％～3.4％²。截止目前，小分子TKI克唑替尼和恩曲替尼已获美国食品药品监督管理局（FDA）和国家药品监督管理局（NMPA）批准用于ROS1融合阳性NSCLC的一线治疗。此外，全球还有多款新药被开发用于治疗ROS1阳性NSCLC，如瑞普替尼（Repotrectinib）、Taletrectinib和洛拉替尼等³。

其中，瑞普替尼作为新一代潜在“best-in-class”ROS1和NTRK靶向抑制剂，具有独特的刚性大环结构，使其能够更加精准地将分子锚定在ATP结合位点上，带来高选择性、高亲和力的特点，进而提高疗效。在2022年分子靶点和癌症治疗研讨会（ENA）中，研究者公布了I/II期研究TRIDENT-1的结果⁴。研究显示，在ROS1-TKI初治队列（EXP-1，n=71）中，经确认的客观缓解率（ORR）为78.9%，4例患者（5.6%）达到完全缓解（CR），52例患者（73.2%）达到部分缓解（PR），临床获益率（CBR）为94.4%（图1）。12个月的DOR率（n=56）和PFS率（n=71）分别为86.1%和79.7%。

图1. EXP-1：ROS1 TKI初治队列的临床活性

既往接受1种ROS1 TKI和1种含铂化疗的经治队列（EXP-2）共纳入26例患者，ORR达42.3%，CBR为73.1%。6个月的DOR率和PFS率分别为63.6%和38.9%（图2）。

图2. EXP-2：既往接受1种ROS1 TKI和1种含铂化疗的经治队列的临床活性

既往接受2种ROS1 TKI且未经化疗的经治队列（EXP-3）共纳入18例患者，ORR为27.8%，CBR为44.4%。6个月的DOR率和PFS率分别为60.0%和22.2%（图3）。

图3. EXP-3：既往接受2种ROS1 TKI且未经化疗的经治队列的临床活性

既往接受1种ROS1 TKI且未经化疗的经治队列（EXP-4）共纳入56例患者，ORR为37.5%，CBR达82.1%（图4）。6个月的DOR率和PFS率分别为79.5%和67.4%。

图4. EXP-4：既往接受1种ROS1 TKI且未经化疗的经治队列的临床活性

在ROS1 TKI经治患者中，共有17例基线伴G2032R溶剂前沿突变，经BICR评估的ORR达58.8%，CBR为70.6%，6个月的DOR率为70.0%（图5）。

图5. 伴ROS1 G2032R耐药突变的ROS1 TKI经治患者的临床活性

TRIDENT-1研究提示，瑞普替尼在ROS1 TKI初治和经治的ROS1融合阳性晚期NSCLC患者中均表现出持久的临床疗效，包括ROS1 G2032R耐药突变患者。基于该研究的优异数据，瑞普替尼治疗ROS1阳性局部晚期或转移性NSCLC成人患者的上市申请已被国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）受理并纳入优先审评，这一举措将加速瑞普替尼在国内的上市进程。期待瑞普替尼尽早上市，在临床实践中为患者带来更好的生存获益。

Q2. 分子病理分型是NSCLC精准靶向治疗的前提，能否请您介绍一下国内融合基因检测的现状，以及目前融合基因检测仍面临哪些挑战？

准确检测出融合基因是个体化治疗的前提，《NCCN非小细胞肺癌临床实践指南（2023年v3版）》和《CSCO非小细胞肺癌诊疗指南（2023版）》均推荐NSCLC患者在治疗前应进行ALK、ROS1、RET、NTRK等融合基因检测³,⁵。基因融合的形成机制多样复杂，主要通过染色体结构在DNA层面形成基因重排，转录后经过剪接形成新的mRNA，并翻译成特殊的融合蛋白。根据DNA层面融合断点位置的不同，基因重排可分为基因内重排、基因间重排和混合性融合¹。此外，部分DNA层面重排不会产生mRNA和融合蛋白。这些多样的融合机制导致了其临床检测的相对复杂性。

目前常见的融合基因检测方法包括：免疫组化（IHC）、荧光原位杂交（FISH）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和下一代测序（NGS）等¹。

IHC是基于蛋白的基因融合检测方法，具有灵敏度高、成本低、检测时间短、易于自动化的特点，但其准确性取决于检测的融合蛋白是否有经过验证的抗体， ALK 融合的免疫组化一致性较高，其他融合检测中IHC仅用于初筛，阳性结果还需其他检测方法进行验证。

FISH技术利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子杂交，通过观察荧光信号，来确定目标基因分离或融合状态。FISH检测灵敏度和特异度较高，是融合检测的“金标准”，但该方法不能明确融合伴侣基因信息，且对罕见变异类型可能存在假阴性结果，例如GOPC‑ROS1融合。此外，FISH检测方法通量较低，每次只能检测某一种类型的融合，且检测成本相对较高，临床应用具有一定的局限性。

RT‑PCR可在RNA层面检测基因融合，优势在于检测周期相对较短（2~3天），简便易行，灵敏度和特异度较高，能同时明确已知的融合变异类型，是目前院内病理科最为常用的融合检测平台。RT‑PCR可覆盖绝大部分融合基因类型，仅少部分低频罕见融合伴侣未覆盖。

NGS根据检测基因分子的类型不同分为基于DNA水平或RNA水平进行基因融合检测，具有样本限制较少、灵敏度和特异度高、通量大等优点。

DNA‑NGS：其优势在于能够在DNA水平确定基因融合的断点位置和融合伴侣，检出已知和未知的基因融合/重排。若无法获得组织学/细胞学标本或者标本量不足以进行检测，可以从体液标本中提取ctDNA进行NGS检测。但DNA‑NGS的准确性受肿瘤细胞含量、标本DNA质量、捕获探针覆盖度及DNA层面复杂基因变异等影响，对于复杂及罕见融合类型可能会出现漏检。此外，DNA水平检测到的部分罕见融合断裂位点可能并不能代表RNA水平的融合位点，在极少数情况下，DNA水平上检测到的基因易位并不会引起融合基因的表达。

RNA‑NGS：RNA-NGS主要在RNA水平上进行检测，与DNA-NGS需要对外显子和内含子区均进行探针捕获相比，RNA-NGS优势在于仅需要针对外显子区设计引物或探针，相对简单、经济，不受DNA层面复杂融合的影响，且RNA-NGS能直接真实地反映转录水平融合的表达情况及融合伴侣基因类型。但是RNA水平检测对样本质量要求较高，具有极强的不稳定性，保存时间较长会导致RNA降解，检测失败率较高，或者可能出现检测结果假阴性，并且目前暂时无法用于血液标本检测。

根据融合基因序列特点，融合基因在RNA水平上检测比DNA水平更敏感。以ROS1融合为例，多个研究及多家检测公司发现，仅使用DNA-NGS会降低融合基因的检出率，若补充RNA-NGS检测，可额外检出20%~30%的ROS1融合⁶,⁷（图6）。

图6. 使用ARMS-PCR+IHC、DNA-NGS和RNA-NGS检测驱动基因改变

DNA-NGS是临床常用的检测方法，目前国内对于融合基因的检测也主要以DNA-NGS为主，但对于融合基因的判定可能会出现假阴性。另外，还有一小部分融合基因仅能在DNA水平上检出，无法形成有功能的融合RNA，临床相关性差，患者靶向治疗获益不佳。RNA-NGS作为有效补充方法，可有效提升临床融合基因的检测准确性，让更多的患者有机会使用对应的靶向治疗药物，但目前国内RNA-NGS使用率较低。

除NGS外，FISH最初是融合基因检测的金标准，但多项研究已显示敏感度不如RT-PCR，而且常规IHC和FISH均受主观因素影响⁸,⁹。RT-PCR作为基于RNA水平的融合基因检测方法，临床应用率仅次于NGS，目前国内多个检测公司已上市相关试剂盒。此外，不同的检测方法检出的融合阳性率存在一定差异。例如，RT-PCR在中国NSCLC患者中检出的ROS1融合阳性率为2.59%¹⁰，而NGS检出的ROS1融合阳性率则为1.56%⁷。值得一提的是，NGS对于DNA和RNA样本要求较高，从而导致检测失败率较高，有日本研究显示，艾德11基因RT-PCR的检测失败率为1.5%，而NGS则为12.2%¹¹，若为RNA-NGS，则失败率可能会更高，这也为临床使用NGS检测提出了挑战。

Q3. 如您刚刚介绍，融合基因检测仍有许多亟待解决的问题，能否请您结合分子病理实践经验，谈谈您认为临床和病理医生如何应对这些问题？

在临床实践中，基因融合复杂多变，检测中存在各种困难，多种检测方法各具有优缺点。临床医生应根据送检标本类型、肿瘤细胞含量、标本质量、所检融合基因特点、平台可及性、检测周期及费用等因素，针对融合检测制定优化策略，合理选择检测平台及方式，必要时可多平台互补和验证，有效提高融合检出率及可靠性，避免漏检错检。

由于基因融合/重排发生的断点并不固定且断点类型较多，因此DNA层面检测较为困难。RNA- NGS可克服DNA水平融合检测存在的挑战，提高融合变异的检出率，临床医生可优先选择基于RNA水平的检测方法，如RNA-NGS、RT-PCR。

目前国内主要以DNA-NGS检测为主，当临床上采用基于DNA水平的方法检测时，若未检出融合基因阳性，应考虑补充基于RNA水平的检测，避免漏检。《少（罕）见驱动变异阳性肺癌诊疗共识》指出，对于少（罕）见驱动基因的检测，推荐大panel的DNA-NGS作为首选，RNA-NGS作为补充；测序基因panel至少应包括不少于50个基因的1类变异。今年6月刚发布的《非小细胞肺癌融合基因检测临床实践中国专家共识（2023版）》同样强烈推荐DNA层面检出的罕见融合伴侣、外显子断点融合及基因间融合应在RNA或蛋白水平进一步验证¹。此外，对于经过广泛基因检测未发现驱动基因突变的患者，《NCCN非小细胞肺癌临床实践指南（2023年v3版）》推荐进行RNA-NGS检测⁵（图7）。

图7. 2023 V3 NCCN非小细胞肺癌诊疗指南-分子和生物标志物分析

小结

精准检测是实施精准靶向治疗的前提，对于不同的NSCLC融合基因，选择准确、快速、恰当的检测方法，全面筛选出适用靶向药物的目标人群具有重要临床意义，当前还需不断优化融合基因检测策略，提高检测准确性，助力开启中国融合基因NSCLC诊疗新时代！