临床研究 | 罕见遗传性多发性骨软骨瘤合并骨质疏松症一例研究并文献复习

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•  基金项目：国家重点研发计划（2018YFA0800801，2021YFC2501704）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目（2021-I2M-C&T-B-007，2021-I2M-1-051）；国家自然科学基金面上项目（81873668, 82070908）；北京市自然科学基金（7202153）

• 作者单位：100730  北京，中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院内分泌科, 国家卫生健康委员会内分泌重点实验室

• 通信作者：李梅，E-mail:limeilzh@sina.com

01

目的 分析以多发骨性突起、骨密度下降为主要表现的一例罕见遗传性多发性骨软骨瘤（hereditary multiple exostoses，HME）患者的临床特点及致病基因突变。

方法 评估临床特点，测量骨转换生化指标、骨密度、骨骼X线。采用二代靶向测序及Sanger测序技术检测并确定致病基因突变。通过文献复习，总结我国HME基因突变研究及HME合并骨质疏松症的国内外研究。

结果 本例主要表现为多发骨性突起，X线检查提示长骨干骺端及右肩胛骨多发外生骨疣，骨转换生化指标正常，腰椎及全髋骨密度为0.973 g/cm2（Z值-1.2）、0.613 g/cm2（Z值-2.7），予阿仑膦酸钠、钙剂和维生素D治疗2年，骨密度明显增加。患者存在EXT1基因第3外显子c.1162C＞T杂合无义突变，导致蛋白糖基转移酶活性结构域缺失。文献显示，我国HME患者主要病因为EXT1或EXT2杂合失活性突变，无明确热点突变，尚未见HME合并骨质疏松症的报道。

结论 HME是罕见的常染色体显性遗传骨病，表型主要包括多发骨性突起、肢体畸形、疼痛等，主要病因为EXT1或EXT2突变，EXT1基因失活突变可能为本例患者HME合并骨质疏松症的原因，本研究丰富了HME致病基因突变谱和表型谱。

02

遗传性多发性骨软骨瘤；骨质疏松症；EXT1基因；双膦酸盐类

03

遗传性多发性骨软骨瘤（hereditary multiple exostoses,HME）是一种罕见的常染色体显性遗传骨病，典型表现为覆盖软骨的多发良性外生骨疣，欧美人群患病率约为1/50 000［1］。绝大多数HME患者可检测到肿瘤抑制基因EXT1（exostosin glycosyltransferase-1）或EXT2（exostosin glycosyltrans-ferase-2）杂合失活突变，这两种致病基因属于EXT基因家族，分别位于人类染色体8q24.11及11p11.2，编码的糖基转移酶各有746和718个氨基酸。目前认为HME与EXT蛋白缺陷导致硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）合成异常有关［2-3］。

HME常于儿童期和青春期起病，骨疣多见于长骨干骺端，随人体骨骼生长，在骨骺闭合时骨疣通常停止生长，但0.5%~5%患者骨软骨瘤可能恶变为软骨肉瘤或骨肉瘤［2,4-5］。骨软骨瘤可能合并全身骨骼代谢异常，影响正常骨骼发育，导致身材矮小、骨骼畸形，也可能压迫周围正常结构，导致疼痛、活动受限等［6］。2005年Manuel等［7］首次报道EXT1基因剪接突变引发了HME合并骨质疏松症的家系，但两种疾病共患的机制未完全阐明，我国尚未见HME合并骨质疏松症病例报道。

为深入了解HME合并骨质疏松症的临床特点和致病机制，本研究调查1例HME合并骨质疏松症患者的临床特点，进一步检测致病基因突变，前瞻性观察双膦酸盐类药物对骨质疏松症的疗效。通过复习文献，总结我国HME基因突变研究及HME合并骨质疏松症的国内外研究，以拓展对罕见疾病HME的认识。

资料与方法

临床资料

患者女，28岁，因“发现多发骨性突起20余年，发现骨质密度减低2年”，于2019年10月就诊北京协和医院内分泌科。患者自幼发现多发骨性突起，部位包括右肩背部、前臂、手指、髋部、膝部、踝部，伴局部疼痛，外院诊为“多发性骨软骨瘤”，曾行右上肢、双膝及右踝骨疣切除手术，目前仍有多发骨性突起。2017年患者因腰背及双下肢疼痛，于外院X线检查发现骨密度减低，间断补钙，骨痛无明显缓解。患者无身高变矮，否认骨折史，无口渴、多饮、多尿，否认尿中排结石。否认频繁口腔溃疡、皮疹、光过敏。否认偏食，近期体重无明显变化。既往：否认糖皮质激素治疗史。家族史：否认父母近亲婚配，家族中无类似患者。查体：血压114/79 mmHg，心率70次/min，身高168 cm，体质量51 kg，BMI 18.1 kg/m2；未见明显四肢畸形及步态异常；右肩胛骨区、右膝部、右手中指近节可及突起，质硬，无压痛（图1A）。

本研究获北京协和医院科研伦理委员会批准，研究开始前征得患者同意，并签署知情同意书。

辅助检查：（1）骨代谢指标：血清钙（Ca）、磷（P）、骨形成指标总碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）及Ⅰ型胶原氨基端延长肽（procollagen type 1 N-peptide，P1NP）、骨吸收指标β-胶原降解产物（β-isomerized carboxy-telopeptide of type Ⅰ collagen，β-CTX）、25羟维生素D（25 hydroxyvitamin D，25OHD）、甲状旁腺素（intact parathyroid hormone，PTH）均正常（表1）。（2）血尿常规、肝肾功能正常。（3）其他内分泌检查：甲状腺激素、血皮质醇、性激素均正常。免疫及炎症相关指标均阴性。（4）影像学检查：双能X线骨吸收仪测骨密度（bone mineral density,BMD）结果：腰椎2-4 BMD 0.973 g/cm2（Z值-1.2），全髋BMD 0.613 g/cm2（Z值-2.7）。X线平片：右肩胛骨、左桡骨远端、双尺骨远端桡侧、右手中指近节指骨、右股骨近远端、双胫腓骨近远端可见外生性骨疣，符合多发性骨软骨瘤；腰椎正侧位未见明显异常（图1B~I）。全身骨显像：右肩胛骨、双腓骨近远端、双胫骨近端见放射性摄取增高灶，符合多发性骨软骨瘤表现（图1J）。

治疗及随访：本例诊为“遗传性多发性骨软骨瘤、骨质疏松”，给予阿仑膦酸钠70 mg 每周1次、碳酸钙D3片600 mg每日1次、骨化三醇胶囊0.25 μg隔日1次。服药后患者无明显上腹不适，治疗期间无新发骨折，骨转换生化指标明显降低，骨密度显著增加（表1），仍有间断腰背部、右肩部、双踝关节、双髋部疼痛。

致病基因突变检测

采集患者外周静脉血，提取白细胞基因组DNA（QIAamp DNA Blood Mini 试剂盒，德国）。采用二代靶向捕获测序技术检测基因突变，基因芯片涵盖早发骨质疏松症、成骨不全症等遗传性骨病相关致病基因700余种，包括HME候选基因EXT1、EXT2。测序目标区域碱基覆盖度为98.95%，测序深度200×。应用SOAPsnp和SAMtools软件行单个核苷酸突变和插入/缺失突变查询，并与数据库（NCBI dbSNP、the 1000 Genomes Project、NHLBI）进行比对，查找可能的基因突变。

对于二代靶向测序识别的突变基因，应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增目的基因外显子及其与内含子交界片段。采用Primer 3设计引物，PCR反应体系：Taq mix 15 μL、正反向引物各1 μL、双蒸水11 μL和基因组DNA 2 μL。PCR反应条件：预变性95 ℃×2 min，变性95 ℃×30 s，退火60 ℃×30 s，延伸72 ℃×60 s，循环35次；总延伸72 ℃×10 min。PCR扩增产物纯化后采用荧光自动测序仪（ABI3700，美国）测序。EXT1和EXT2测序结果分别与参考序列NM_000127.3和NM_207122.1比对，以确定突变位点及类型，进一步与人类基因突变数据库（HGMD）进行比对，确定其是否为新突变位点。采用Mutation Taster（https://www.mutation-taster.org）进行变异位点有害性预测。根据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）变异解读指南进行变异致病性分析［8］。

文献复习

以“遗传性多发性骨软骨瘤、EXT1和EXT2”为主题词检索PubMed及万方数据库，查阅、总结我国HME患者的临床及基因突变特点。以“遗传性多发性骨软骨瘤、骨质疏松症”为主题词检索PubMed及万方数据库，查阅、总结HME合并骨质疏松症的病例特点。

结果

临床特点

患者青年女性，幼年起病，表现为多发骨性突起，伴局部疼痛，X线片可见多发外生性骨疣，部位主要包括肩胛骨、四肢长骨。患者同时伴有腰椎及股骨近端BMD降低，予阿仑膦酸钠、钙剂、维生素D治疗2年，血清ALP、β-CTX下降，BMD明显增加（图2）。

致病基因突变

基因检测提示患者存在EXT1基因第3外显子c.1162C＞T杂合突变（图3A），该位点在进化中高度保守（图3B），该变异致编码谷氨酰胺的第388位密码子CAG变为终止密码子TAG，产生截短蛋白（图3D,E）。Mutation Taster预测该突变可致病，HGMD提示其为已报道的HME致病突变［9-10］。根据ACMG指南，变异符合致病性证据：无义突变致蛋白功能丧失、在正常人群变异数据库中未发现、软件预测有害，可判定其为致病性变异（PVS1+PM2+PP3）。

我国HME患者的基因型、表型谱分析

复习文献，我国HME基因突变谱见表2［11-17］，纳入211例HME患者，男女各144（68%）及67例（32%），起病年龄为（4.4±2.8）岁，主要表型：多发骨性突起（100%）、肢体畸形（52.4%）、身高变矮（70%患者低于P50）、疼痛（8.3%）。75%患者的骨软骨瘤数超过10处，主要集中在长骨干骺端，少数患者可累及肋骨、肩胛骨、髂骨等。我国患者中92.9%检测到EXT1或EXT2致病性突变，其中EXT1及EXT2突变分别占54.6%及45.4%，突变类型包括移码、无义、错义、剪接及其他突变，各占30.1%、26.5%、16.8%、9.2%及17.3%。国人未见明显热点突变。

本例患者合并骨质疏松，国内外关于HME合并骨质疏松症罕有报道（表3）。Lemos等［7］报道HME家系中，骨质疏松患者比例高达90%(9/10)，考虑为EXT1剪接突变影响EXT1蛋白的糖基转移酶活性结构域所致。有研究对20例青中年HME患者的骨密度及骨代谢指标进行测量，结果显示2例合并骨质疏松症，12例合并骨量减少，且股骨颈骨密度Z值较腰椎更低，骨代谢指标均正常［18］。

讨论

本研究确诊1例以多发骨性突起，伴有骨密度明显下降为主要表现的HME青年女性患者。骨软骨瘤位于长骨及肩胛骨，腰椎和股骨近端骨密度明显下降，骨转换生化指标正常。基因检测提示患者存在EXT1杂合无义突变（c.1162C＞T），突变导致EXT1蛋白截短变异，根据ACMG标准判定为致病性变异。

EXT1和EXT2蛋白是内质网具有糖基转移酶活性的跨膜糖蛋白，参与HS生物合成过程中的链延长，两者结合形成的复合物具有更高的酶活性，因而EXT1或EXT2失活突变者糖基转移酶活性下降，可引起HS合成减少［19-20］。研究发现HS在调节生长发育方面具有重要功能，其与成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）、hedgehog家族等信号蛋白相互作用，从而调节软骨细胞分化［2,6］。HS缺乏可引起长骨生长板旁软骨膜的异位BMP高表达，并抑制FGF信号，诱导异位软骨形成和骨软骨瘤样发育［6,21-23］。通常认为，EXT基因的杂合突变可能不足以启动骨软骨瘤形成，HME的起病与体细胞突变 “二次打击”引起局部HS进一步缺乏有关［1,22,24］。

HME表型异质性高，基因突变谱复杂。我国HME患者多于儿童期起病，男女比例约为2:1，略高于欧美人群1.5:1，主要表型包括多发性骨性突起、肢体畸形、身高变矮，骨软骨瘤多位于长骨干骺端［1］。我国超过90%的HME患者可检测到EXT1或EXT2致病性突变，前者更常见，突变类型以移码、无义突变为主，未见明显热点突变［6］。基因型-表型相关性分析提示EXT1突变较EXT2突变者骨软骨瘤数量更多、身高更矮，且肢体畸形、骨盆和扁骨受累更常见［25-27］，EXT1突变更可能导致严重临床表型［11,14］，这可能是由于EXT1蛋白可单独完成HS的链延长，而EXT2蛋白单独作用较小［28-29］。

本例患者除了多发骨疣外，合并骨密度下降，达骨质疏松症诊断标准［30-31］。Matsumoto等［18］发现HME患者70%合并骨量减少或骨质疏松，提示骨质疏松是HME患者较为常见的问题，值得重视。EXT1蛋白包含3个主要结构域：跨膜结构域、Exostosin结构域、糖基转移酶活性结构域［16,32］，本例存在截短的EXT1蛋白，缺失糖基转移酶活性结构域，骨密度特点与以往研究显示的HME合并骨质疏松症相符，提示本例合并的骨质疏松症可能与EXT1突变有关。EXT1突变影响骨稳态的机制尚未完全阐明，研究显示EXT1敲除杂合小鼠表现为HS缺乏，骨吸收增加，骨密度下降［33］。成骨细胞表面的HS能够与护骨素（osteoprotegerin,OPG）相互作用，并将OPG锚定在成骨细胞表面，维持其局部高浓度，从而抑制核因子κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL）与核因子κB受体活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB,RANK）的结合，抑制破骨细胞分化及骨吸收活性，而EXT1突变可引起HS合成减少，通过影响OPG/RANKL/RANK途径加快骨吸收，这可能是HME合并骨质疏松症的主要机制［19］。

目前HME主要治疗是瘤体切除及矫形手术，动物研究提示肝素酶抑制剂、选择性维甲酸受体γ激动剂帕罗伐汀等药物可能有效，值得深入探索［34-35］。尚未见HME合并骨质疏松症的治疗及随访报道，本例接受阿仑膦酸钠、钙剂和维生素D治疗两年，骨吸收减少，骨密度增加，提示骨吸收抑制剂对HME合并骨质疏松症可能有效，但仍需大样本研究证实。

综上，HME是一种罕见的遗传性骨病，疾病表型主要包括多发骨性突起、肢体畸形、身材矮小、疼痛等。我国患者的主要致病原因为EXT1或EXT2突变，以移码和无义突变为主，EXT1失活突变可能是导致本例HME合并骨质疏松症的病因，本研究丰富了HME的基因突变谱和临床表型谱。