学术速递 | 蒋青教授：间充质干细胞在膝OA及软骨损伤修复中的现状与未来

（一）MSCs具有分化成软骨细胞，控制炎症和免疫调节作用

在一定条件下，MSCs能够被诱导分化成软骨细胞实现软骨再生，如添加转化生长因子（TGF）-β3、骨形态发生蛋白（BMP）等软骨分化诱导因子，低氧环境、三维立体（支架或微载体）。MSCs也可分泌大量细胞因子或生长因子，通过旁分泌作用于软骨细胞促进细胞增殖，并分泌更多软骨细胞外基质。

MSCs具有炎症或免疫调节作用，有研究发现，关节腔内注射骨髓MSCs（BMSCs）治疗OA，膝关节内炎性细胞和白细胞介素（IL）-12水平明显更低，这与MSCs分泌一些生长因子或细胞因子发挥炎症或免疫调节作用密切相关，如干扰素γ（IFN-γ）、IL-10、肝细胞生长因子（HGF）、前列腺素E2（PGE2）、TGF-β1、一氧化氮等，通过这些因子缓解局部炎症反应，维持微环境稳态，从而达到缓解疼痛等症状的目的。

（二）MSCs来源丰富

用于治疗OA的MSCs来源丰富，按组织来源可分为BMSCs、脂肪MSCs（ADMSCs）、滑膜MSCs（SMSCs）、外周血MSCs（PBMSCs）以及脐带MSCs（UCMSCs）和胎盘MSCs（PMSCs）等。根据是否为同种异体来源，又分为自体或同种异体MSCs。

临床中用于治疗软骨损伤或OA的MSCs以自体细胞为主，多为骨髓血和脂肪组织来源，少量报道来自同种异体骨髓血、脂肪组织或围产期组织。不同组织来源的MSCs具有各自的优缺点。自体MSCs不会带来疾病传播的风险，患者接受程度好，安全性好。但是，获取比较麻烦，从分离到获取治疗量的MSCs用时较长（约20d），供体损伤，且细胞的活性可能受到健康状态及年龄的影响。研究认为，MSCs的特性和再生潜能会受到心血管疾病的影响，体外多次传代扩增后，细胞的代谢、分化和分泌功能会发生改变。由于MSCs低表达HLA-Ⅰ型抗原，不表达HLA-Ⅱ型抗原，具有免疫源逃避的能力，同种异体MSCs多为商业化产品，随用随取，使用方便、经济。尽管MSCs免疫原性更低，但并不具有免疫豁免能力。一项研究发现，在马的关节腔内注射等量的自体和同种异体BMSCs，第一次临床治疗效果无明显差异，而在第二次注射时出现了明显的不良反应和严重的炎症反应。

对于不同组织来源的MSCs也各具特点。骨髓来源MSCs是临床中较常见的细胞来源，但对有血液系统或骨髓疾病的患者是不适合的，且常需要多个穿刺点方可获取足量骨髓血，否则会混合较多的外周血，导致获取效率下降。脂肪来源MSCs具有脂肪组织来源丰富，单次可获取足量MSCs，同样供区也会带来新的损伤或不良并发症，如伤口感染等。滑膜组织来源自体MSCs被证实具有很好的软骨再生潜能且不易分化成骨。外周血中提取MSCs比较方便，获取部位损伤小，但是MSCs获取率低。围产期组织，如胎盘、羊膜或脐带，来源丰富，为产后废弃组织，为临床提供很好的MSCs资源，也被认为较成体组织更年轻，分离的MSCs具有更高的活性和多项分化潜能。但是，目前尚未建立个人围产期组织库，临床中围产期组织来源干细胞均为同种异体细胞，具有潜在的疾病传播风险。

因此，细胞的来源选择除了考虑细胞自身特性外，还需根据患者的健康状况综合考虑，进行个体化权衡。对于年轻患者，无其他基础疾病，自体来源的原代MSCs可能是更好的选择。对于老年患者，且合并有心血管或其他系统疾病，应用同种异体MSCs，可以减少对患者自身带来的损害，同时规避自身来源干细胞生物学特性不佳的顾虑。合并有血液系统疾病的患者，不宜从骨髓或外周血中提取MSCs。至于，不同组织来源的MSCs在治疗软骨损伤或OA的潜能缺乏全面系统的比较，很难判断优劣，需要进一步研究证实。

（一）临床研究设计类型及样本特征

关于MSCs治疗软骨损伤或OA的临床研究多以随机对照设计为主，还涉及队列研究或回顾性研究等，遍布全球近20个国家，其中以来自美国、意大利、韩国、中国的文章居多，其中美国开展较早。纳入样本量多为15~50例，50例以上研究约占29%，患者年龄平均在50岁左右（18~80岁），无未成年人参与。患者不宜过胖，体质指数（BMI）约25kg/m²，不超过35kg/m²。膝关节病损情况以轻中度为主，以KellgrenLawrence（K-L）Ⅱ~Ⅲ级患者为主，少量纳入K-L Ⅳ级OA患者。

（二）MSCs的临床干预方案

1. 细胞剂量和频次：主要以混悬液注射到关节腔内。单次注射为主，仅4项临床研究在2个时间点分别注射。MSCs的混悬剂以生理盐水、磷酸盐缓冲溶液或细胞培养基为主。单次注射细胞剂量多数为（20~50）×106，低至3.4×104个原代自体细胞，高达400×106个扩增细胞，悬液一般在5ml，最多不超过10ml。对于MSCs的单次注射剂量或注射次数对治疗效果是否有明显依赖关系，不同研究结果不一。有研究认为，治疗效果与细胞数量的增多无明显相关性，甚至高浓度的细胞悬液会引起更多的不良反应，如关节肿痛。在两项应用同种异体BMSCs的研究中，均为低剂量组（分别为25×106和50×106）获得更好的疼痛缓解和软骨修复，且高剂量组（150×106）发生更多的不良反应。在两项应用同种异体ADMSCs的研究中，低剂量组（分别3.9×106和10×106）获得更好的疼痛和关节功能改善。而在自体MSCs的研究中获得的结果差异更大。在6项研究中2项得出高剂量组（分别为自体BMSCs>400×106和ADMSCs100×106）获得更好的疼痛缓解和软骨修复，1项研究得出低剂量组（ADMSCs2×106）观察到明显的疼痛缓解和功能改善，1项研究在中等剂量组（ADMSCs20×106）观察到最好的软骨修复和膝关节的功能改善，另外2项研究发现，高剂量和低剂量组均获得很好的膝关节功能评分，如自体血管基质组分剂量为15×106和30×106的治疗效果无明显差异，自体BMSCs剂量为10×106和100×106在12个月随访时，高剂量组影像学改善更明显，在4年随访时低剂量组疼痛缓解更佳。

可见，对于同种异体MSCs来说，低剂量可获得更好的临床治疗效果，高剂量的异体细胞可能带来更多不良反应。对于自体MSCs来说最佳剂量差异较大，影响这些结果的原因可能是多方面的，包括细胞的组织来源不同，制备处理工艺不统一，还有患者自身基础健康状况等。

2. 细胞注射部位：除了关节腔内注射，也有学者进行软骨下骨注射。一项研究将骨髓浓聚成分（MSCs、骨髓造血干细胞和细胞因子、生长因子等）注射在膝关节软骨下骨位置，与关节腔内注射相比，其能够很好地修复软骨下骨髓损伤，随访15年，软骨下骨组全膝关节置换率更低（20%比70%），较对照组平均延迟10年进行全膝关节置换术。另一项将PBMSCs联合透明质酸(HA)进行软骨下骨注射治疗膝关节股骨髁软骨损伤，随访24个月，获得更明显的临床症状缓解和影像学改善。如果关节腔内注射MSCs能够不同程度地修复损伤的软骨，软骨下骨注射是对损伤的软骨下骨进行修复，可见关节软骨或软骨下骨的修复均能一定程度上缓解OA临床症状，延迟关节置换时间。

3. 附加干预措施：除了关节腔内注射MSCs，根据患者具体病情会相应增加针对性的干预措施。如关节腔注射MSCs前，应用关节镜进行关节腔清理，韧带重建或修复治疗膝关节韧带损伤，胫骨高位截骨纠正关节外畸形，半月板成型或缝合术治疗半月板损伤，软骨损伤处行微骨折处理。有研究将MSCs与HA或富血小板血浆(PRP)混合后进行关节腔注射，结果发现MSCs联合其他成分较单独治疗获得更好的治疗效果。

4. 术后康复措施：关节腔注射MSCs的治疗当天限制活动，以后可进行正常日常活动。但避免过度或剧烈的负重活动，以避免修复软骨的进一步损害。关节的非负重活动可促进软骨组织内部营养物质的交换，促进细胞的代谢活动，有利于软骨的修复。若联合其他外科操作，如韧带重建、微骨折术及高位胫骨截骨等，需要根据具体操作调整康复计划，通常术后4~6周内行非负重等张股四头肌肌力和活动范围训练，4~6周后开始部分负重和本体感觉训练，以后逐渐恢复全部负重和基本生活。

（一）随访时间及评价工具

临床随访多在术后1~2年结束随访，仅少量研究随访至5年以上。数据内容包括功能评分和影像学检查，个别研究包含二次关节镜探查或组织学染色。具体内容包括：疼痛评分、Lysholm评分、Tegner运动评分、国际膝关节文献委员会（IKDC）评分、健康状况调查简表（SF-36）、膝关节损伤与骨关节炎评分（KOOS）、下肢功能量表（LEFS）评分和WOMAC评分，以及X线、MRI检查和关节镜探查取材活检等。

（二）临床疗效

1. 临床症状有效缓解：从现有的临床研究证据可见，与口服NSAID类非甾体抗炎药，关节腔注射糖皮质激素，生理盐水，HA，或PRP相比，关节腔内注射MSCs能够很好地减轻关节疼痛，改善关节活动度，提高患者生活质量。

2. 损伤软骨的修复与再生证据不足：对于MSCs到达关节腔内能否实现软骨修复或再生的证据不足。在纳入的60项临床研究中，只有不到1/3的研究随访中观察到软骨损伤处有明显的组织填充或软骨生成。Kuroda等将自体BMSCs与胶原水凝胶混合后移植在1位运动员的内侧股骨髁全层软骨缺损处，术后7个月关节镜观察及组织学染色可见透明样软骨再生。Jo等[58]纳入18例患者行关节腔内注射自体ADMSCs，术后半年行关节镜二次探查和组织学染色，发现高剂量组（1×108）软骨缺损处部分被透明样软骨填充。Koh等报道，将ADMSCs联合微骨折术治疗膝关节软骨缺损，2年后行关节镜和组织学染色发现软骨缺损处有较好的修复，组织学染色评分更优。Park等将同种异体UCMSCs与HA混合关节腔注射治疗K-L Ⅲ级OA患者，术后1年组织学观察可见透明样软骨生成。Kim等通过胫骨高位截骨（HTO）术联合关节腔注射自体ADMSCs治疗OA，术后2年关节镜检查发现获得明显的软骨再生。

关节腔注射MSCs是否能够获得软骨的修复与再生是个很重要的问题，需要更多客观严谨的评价手段。二次关节镜探查和（或）组织学染色能够提供很好的证据，但是迫于临床研究伦理问题，这方面的证据稀缺，这些研究多联合其他治疗手段联合干预，很难定量MSCs在软骨修复与再生方面做出多大贡献。MRI技术检测简单无创，患者接受度高。但是，不同次MRI检测参数前后很难一致，不同级别机器的精度也有差异，层面很难前后严格匹配，不同的阅片医师读片也存在差异，它们所带来的误差不可忽略，影像学证据强度较弱。缺损处的新生组织是通过MSCs的营养作用促进自体细胞增殖修复，或是MSCs分化为软骨细胞实现的再生，也需要更深入的研究。

3. 不良反应少，安全性高：关节腔内注射MSCs多无明显不良反应，少数报道注射部位疼痛和关节肿胀为主，其中疼痛发生率为2%~82%，关节肿胀为2%~53%。有少数报道，术后出现关节僵硬，腰疼，深静脉血栓和髌前滑囊炎等。分析关节痛和肿胀的原因，可能与穿刺技术，MSCs剂量或浓度高，或关节腔内细胞死亡而引起的炎症反应相关。而关节僵硬和深静脉血栓形成可能因合并胫骨截骨矫形或微骨折等，导致术后关节制动时间较长，局部加压包扎过紧所致。总之，关节腔内注射MSCs治疗软骨损伤，安全性好，无严重不良反应。

1. MSCs治疗关节软骨损伤或OA临床应用前景：MSCs治疗关节软骨损伤或OA具有明确的基础研究理论依据，在临床试验中，也证实能够很好地缓解关节疼痛，改善膝关节功能，但缺乏有力证据能够获得透明软骨的再生。在细胞来源方面，以自体骨髓和脂肪为主，围产期组织来源的MSCs在细胞生物特性上更具优势，资源更丰富，未来具有更大的开发应用前景。在给药剂量和频次上变异较大，一般来说同种异体MSCs单次剂量不宜过大，单次注射为宜，大剂量或多频次可能带来更多的不良反应。而自体MSCs因受患者健康状况等多种因素影响，最佳治疗剂量波动范围较大。除关节腔内注射MSCs，软骨下骨注射也被证实具有良好的治疗作用，并能够明显延缓关节置换时间，但相关研究较少，需要更多研究加以证实。术后康复中，关节腔内注射MSCs后，多以休息为主，避免过度负重或剧烈运动。对于合并其他手术操作的需要根据具体术式制定个性化康复计划，以保证良好的治疗效果。在不良反应方面，主要为局部关节肿胀、疼痛，但多能自我康复，无需其他干预措施。

2. MSCs治疗关节软骨损伤或OA的挑战：未来关节腔内注射MSCs治疗软骨损伤或OA仍面临诸多挑战。需要系统地比较，选择最佳的MSCs来源。探索和制定出应用于临床的安全的规范的MSCs提取、扩增和培养操作标准。MSCs应用于临床治疗软骨损伤或OA的标准方案，包括适应证的选择、注射部位、剂量和频次、术后康复计划、不良反应的处置、科学客观的临床疗效评价技术等。另外，需要深入研究和明确关节腔内MSCs的生物学行为，如何将关节腔内注射的MSCs从无目的、随性的，转向定向迁移至软骨损伤处进行靶向修复的高效治疗轨道上，实现自主修复和再生透明软骨。

3. MSCs的衍生成分或生物材料的临床应用前景：关于MSCs的衍生成分或生物材料辅助治疗OA或修复软骨损伤方面也开展了大量的基础研究，并展现了较好的应用前景。MSCs来源的细胞因子、生长因子或外泌体发挥治疗效应，能够促进软骨细胞增殖、迁移，或抑制软骨细胞退变、凋亡等作用，同时能避免细胞带来的免疫排斥等不良反应，对软骨修复具有很重要的应用价值。但是，由于细胞分泌的活性成分与细胞本身活性和代谢状态紧密相关，如不能很好地控制细胞良好的生理状态，其分泌或产生的活性成分也受到极大的影响，影响生物效应的发挥。生物材料在再生医学中扮演着重要的角色，能够作为细胞或外泌体的载体，或提供一定的空间结构和力学支持，将它们定向移植至软骨损伤处，促进细胞的增殖和黏附，同时能够延长有效的作用时间，有望将MSCs或其衍生成分在OA的治疗上推向更高水平。